邰苗苗，郭永娟，任有蛇，張春香

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801）

上世紀(jì)動物細(xì)胞培養(yǎng)開始出現(xiàn)，現(xiàn)今已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)及生物學(xué)中廣泛采用的技術(shù)方法之一。對于附睪細(xì)胞的培養(yǎng)是在上世紀(jì)90年代初才逐漸被重視的［1］。目前，附睪細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法主要有兩種：一種方法是將無菌附睪剔除脂肪后，將組織塊用胰蛋白酶消化，形成細(xì)胞團(tuán)后，重懸于含5%胎牛血清的培養(yǎng)液［2］；另外一種方法是胡向農(nóng)等［1］報道的方法。無菌取出大鼠附睪，用眼科剪將組織剪成1～2mm3的小塊，用胰蛋白酶和膠原酶I消化后，將收集后的細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。然而，關(guān)于山羊附睪頭細(xì)胞培養(yǎng)的研究報道還較少。因此，本試驗擬在上述原代附睪細(xì)胞培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，實現(xiàn)對太行青山羊附睪頭細(xì)胞原代培養(yǎng)和凍存，為山羊附睪特異表達(dá)蛋白功能的研究提供第一手材料。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗選取15日齡太行青山羊公羔附睪頭組織作為試驗材料，試驗動物選自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院試驗基地。

1.2 主要試劑

細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12、無菌PBS、姬姆薩染液、胰蛋白酶購自博士德生物公司。Guava ViaCount Reagent、GuavaInstrument Cleaning Fluid購自北京強欣博瑞生物技術(shù)有限公司。秋水仙素購自TaKaRa公司。胎牛血清（Gibco）、膠原酶I及青霉素鏈霉素混合液（雙抗）購自北京博雅宏興科技發(fā)展有限公司。KCl、NaCl、冰醋酸、甲醇等常用試劑均購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。二甲基亞砜（DMSO）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 山羊附睪頭組織的獲取

選取15日齡公山羊，剪去陰囊周圍羊毛，消毒陰囊及腹部皮膚，無菌去勢，取出附睪和睪丸組織，用含雙抗的溫?zé)釤o菌PBS沖洗，然后用無菌剪刀取下附睪頭部組織并浸泡入37℃預(yù)熱的含雙抗無菌PBS中，盡快帶回實驗室。

1.4 附睪頭細(xì)胞原代培養(yǎng)

采用酶消化培養(yǎng)法。用37℃預(yù)熱的含雙抗無菌PBS沖洗附睪頭組織，去除被膜及血管，洗凈血污。然后用眼科剪將附睪頭組織剪成1mm3大小，移入離心管中，加入0.25%的胰蛋白酶5mL，37℃、80 r/min振蕩30min。終止消化后離心5min，吸去上清，留沉淀。加入2mg/mL的膠原酶I3mL，37℃、80 r/min振蕩60min。用200目細(xì)胞篩過濾，再用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌2～3次，吸去上清。用0.22μm濾器過濾的含血清細(xì)胞培養(yǎng)液（88%DMEM/F12，10%胎牛血清，2%雙抗）重懸細(xì)胞，移入25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。之后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況并根據(jù)細(xì)胞的生長代謝情況更換培養(yǎng)液。

1.5 附睪頭細(xì)胞傳代和凍存

圖1 山羊附睪頭細(xì)胞原代培養(yǎng)生長情況（100×）

當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞匯合達(dá)到90%以上后棄掉舊液，用PBS洗滌2次；加入37℃預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶2mL，37℃消化3～5min，輕輕拍打，顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓、脫壁時，立即用含血清培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液吸出放入離心管中，離心去上清。傳代的細(xì)胞加入含血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，分別接種至2個培養(yǎng)瓶中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；凍存的細(xì)胞加入1mL細(xì)胞冷凍保護(hù)液（70%DMEM/F12，20%胎牛血清，10%DMSO）重懸細(xì)胞后，4℃放置 40min，-20℃放置 90min，-80℃放置過夜，投入液氮中。

1.6 附睪頭細(xì)胞復(fù)蘇

細(xì)胞復(fù)蘇方法參照劉海濤等［3］所報道的棄去凍存液后換上新鮮的完全培養(yǎng)基。此后，根據(jù)細(xì)胞的生長代謝情況更換培養(yǎng)液，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。

1.7 附睪頭細(xì)胞生物學(xué)特性觀察

1.7.1 形態(tài)學(xué)觀察 每隔1天觀察并記錄附睪頭上皮細(xì)胞生長狀況。

1.7.2 生長曲線繪制 用傳至第3代的附睪頭細(xì)胞進(jìn)行生長曲線的繪制。取附睪頭細(xì)胞，用Guava EasyCyte進(jìn)行計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔約50 000個細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔24小時用胰蛋白酶隨機消化收集3個孔中的細(xì)胞，取細(xì)胞懸液50μL，加入450μLGuava ViaCountReagent，混勻，室溫避光10min，用Guava EasyCyte進(jìn)行計數(shù)，求平均值，連續(xù)記錄8 d。依據(jù)試驗數(shù)據(jù)，繪制生長曲線。24孔板其余孔每2天更換培養(yǎng)液一次。

1.7.3 染色體分析 按照常規(guī)方法進(jìn)行染色體制片，姬姆薩染液染色后自然干燥，封片，油鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊附睪頭細(xì)胞原代培養(yǎng)結(jié)果

組織塊消化后，細(xì)胞密度較大，細(xì)胞剛從組織塊中消化分離出，體積較小，形態(tài)多呈圓形。原代培養(yǎng)1 d后，顯微鏡下觀察，還存在部分細(xì)胞團(tuán)，沒有完全消化，細(xì)胞貼于培養(yǎng)瓶底壁，且均處于生長狀態(tài)。培養(yǎng)2 d后，細(xì)胞生長狀態(tài)很好，融合度達(dá)到90%以上，可以看出還有部分細(xì)胞團(tuán)（圖1）。

2.2 傳代培養(yǎng)結(jié)果

圖2 山羊附睪頭細(xì)胞傳代培養(yǎng)生長情況（100×）

附睪頭細(xì)胞經(jīng)過連續(xù)傳代后，細(xì)胞生長狀態(tài)仍良好，下圖分別為原代細(xì)胞傳至第1代和5代后第2天的細(xì)胞形態(tài)，可以看出細(xì)胞能夠穩(wěn)定地傳代，大的細(xì)胞團(tuán)明顯消失，傳代后的細(xì)胞能夠保持原有的細(xì)胞形態(tài)，維持之前的生長速度，2 d左右細(xì)胞基本匯合。

2.3 山羊附睪頭細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)結(jié)果

圖3 山羊附睪頭細(xì)胞復(fù)蘇后生長情況（100×）

山羊附睪頭細(xì)胞經(jīng)過凍存、復(fù)蘇后，細(xì)胞生長狀態(tài)仍良好，細(xì)胞形態(tài)與原代細(xì)胞形態(tài)相似，3 d左右細(xì)胞基本匯合（圖3）。

2.4 山羊附睪頭細(xì)胞生長曲線

根據(jù)每次記錄的細(xì)胞數(shù)量，以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)，繪制山羊附睪頭細(xì)胞生長曲線（圖4）。細(xì)胞接種第1天，細(xì)胞數(shù)量低于初始接種數(shù)量；從第2～3天開始，細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期；從第5天開始，細(xì)胞生長速度減慢；從第6天開始，細(xì)胞進(jìn)入平臺期。結(jié)果表明，培養(yǎng)的山羊附睪頭細(xì)胞生長趨勢整體呈“S”型，符合細(xì)胞生長規(guī)律。

圖4 山羊附睪頭細(xì)胞生長曲線

2.5 染色體分析結(jié)果

對山羊附睪頭的傳代細(xì)胞進(jìn)行染色體數(shù)目分析（圖5）。結(jié)果表明，山羊附睪頭細(xì)胞的染色體數(shù)目為2n=60，說明山羊附睪頭細(xì)胞經(jīng)過傳代后染色體數(shù)目正常，細(xì)胞狀態(tài)良好。

圖5 山羊附睪頭細(xì)胞染色體（400×）

3 討論

附睪結(jié)構(gòu)和功能分成若干段不同的區(qū)域性管腔環(huán)境，附睪在胎兒剛出生的時候是不成熟的，上皮細(xì)胞在出生后的一段時間內(nèi)才能獲得完全分化的表型［4］。郭麗娜等［5］在對山羊附睪特異蛋白β防御素104a定位時發(fā)現(xiàn)，7日齡的山羊附睪頭上皮細(xì)胞未分化，而60日齡的上皮細(xì)胞開始出現(xiàn)明顯的分化，細(xì)胞呈桿柱狀，游離端出現(xiàn)少量短而粗的微纖毛，管腔增大。本試驗采用的15日齡的山羊附睪頭組織并未分化出上皮細(xì)胞，是以低柱狀細(xì)胞存在，故而沒有對細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分，保留了所有附睪頭組織的貼壁細(xì)胞。

動物細(xì)胞原代培養(yǎng)主要有組織塊貼壁法和胰蛋白酶消化法［6］。范曉梅等［7］在對絨山羊附睪上皮細(xì)胞培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)，兩種方法得到的細(xì)胞形態(tài)無差別，界限清晰，具有良好的分化能力。而組織塊消化法建立細(xì)胞系周期較長，相同時間內(nèi)獲得的細(xì)胞數(shù)少于胰蛋白酶消化法。采用胰蛋白酶消化法改進(jìn)后對原代細(xì)胞進(jìn)行獲取，采用37℃恒溫振蕩、分階段胰蛋白酶和I型膠原酶消化法，既減少了傳統(tǒng)酶消化法每隔一段時間需要進(jìn)行震蕩的步驟，又避免了酶消化時間過長對細(xì)胞造成的傷害，提高了酶的消化率和細(xì)胞的產(chǎn)出量［8］。胡向農(nóng)等［1］和范曉梅等［7］建立附睪上皮細(xì)胞系時使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基，但由于RPMI1640不含無機鹽和次黃嘌呤等物質(zhì)，可能會導(dǎo)致細(xì)胞生長緩慢［9］，故本研究選用了營養(yǎng)豐富的DMEM/F12培養(yǎng)基作為細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，試驗結(jié)果證明細(xì)胞生長狀態(tài)良好，2～3 d基本融合。原代細(xì)胞培養(yǎng)最關(guān)鍵的部分就是如何避免細(xì)胞污染：從手術(shù)去勢開始，所有使用的器械均高溫高壓滅菌后再使用，采取附睪頭組織的刀片和剪刀均經(jīng)過無菌處理，提前準(zhǔn)備好添加了青鏈霉素的溫?zé)酨BS沖洗組織，培養(yǎng)基中也添加了青鏈霉素混合液，組織塊的剪切和細(xì)胞過濾等試驗均在超凈臺操作，這樣可以確保每個環(huán)節(jié)都能夠減少細(xì)菌侵染細(xì)胞的機會，做到無菌培養(yǎng)。

一般的形態(tài)學(xué)觀察之外，本試驗還通過細(xì)胞連續(xù)傳代，凍存和復(fù)蘇，生長曲線測定以及細(xì)胞染色體分析等方面進(jìn)行了細(xì)胞的生物學(xué)驗證，傳代細(xì)胞貼壁較快，呈“S”型曲線增長，復(fù)蘇后死細(xì)胞較少，能夠快速生長起來并且傳代，細(xì)胞的染色體數(shù)目正常，狀態(tài)良好，具有正常的生長速率和核型，呈現(xiàn)接觸抑制和錨定依賴性［2］。

4 結(jié)論

本研究成功建立了太行青山羊附睪頭細(xì)胞系，并對其進(jìn)行了生長曲線測定和細(xì)胞染色體分析等生物學(xué)驗證。應(yīng)用本研究所建立的太行青山羊附睪頭細(xì)胞培養(yǎng)體系可以在體外保持其原形態(tài)特征近1個月。表明，此研究所建立的方法適合太行青山羊附睪頭細(xì)胞的生長。

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