劉復(fù)生

（河南省中牟縣動物疫病預(yù)防控制中心，中牟 451450）

片形吸蟲屬于片形科、片形屬，該病呈世界性廣泛分布，是一種對牛羊、駱駝等反芻動物和人類危害嚴(yán)重的人畜共患性寄生蟲病之一［1］。據(jù)相關(guān)報道，全球約有7億經(jīng)濟(jì)動物感染片形吸蟲，給相關(guān)養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失；此外，近些年來關(guān)于人感染片形吸蟲病的報道也較多，在被調(diào)查的60余個國家與地區(qū)中，約200萬人感染有片形吸蟲病，其中我國云南宜賓縣也有關(guān)于暴發(fā)片形吸蟲病感染人類的報道［2-3］。河南省是我國奶牛主要養(yǎng)殖地區(qū)，為了促進(jìn)奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，本次研究通過對中牟縣奶牛進(jìn)行片形吸蟲病流行學(xué)調(diào)查，對片形吸蟲線粒體nad1基因進(jìn)行擴(kuò)增與分析，鑒定該地區(qū)片形吸蟲的種類，為該病的進(jìn)一步防制提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

此次研究所調(diào)查的4個奶牛場分別來自河南省中牟縣韓寺鎮(zhèn)、萬灘鎮(zhèn)、白沙鎮(zhèn)、大孟鎮(zhèn)，從每個奶牛場中隨機(jī)抽選60份新鮮糞便樣品，共240份，每份樣品50 g左右，分別標(biāo)記后置于封口袋，待檢。

1.2 蟲卵形態(tài)學(xué)鑒定

分別從每個封口袋中取出糞便40 g左右，利用尼龍袋集卵法收集蟲卵，吸取沉渣后在光學(xué)顯微鏡下檢測，并參考相關(guān)文獻(xiàn)，進(jìn)行初步形態(tài)學(xué)鑒定［4］。

1.3 PCR擴(kuò)增

對獲得的片形吸蟲蟲卵進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，用Omega生物技術(shù)公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒提取絳蚴蟲的DNA基因組，以PCR技術(shù)對蟲卵線粒體nad1基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，通過序列分析對蟲卵進(jìn)行分子學(xué)鑒定。其中引物利用宋慧群等［5］設(shè)計(jì)的引物，上游引物F：5’-AGATTCGTAAGGGGCCTAATA-3’（21 bp），下游引物 R：5’-ACCACTAACTAATTCACT TTC-3’（21 bp），引物委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。采用25 μL 擴(kuò)增體系：ddH2O 13.75 μL，MgCl24 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.0μL，上下游引物（50 pmol/L）各 0.25 μL，DNA聚合酶 0.25μL，模板DNA 2μL，混勻后低速離心，并作空白對照。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性 30 s，50℃退火 30s，72℃延伸 30 s，35 個循環(huán)，72℃后延伸5 min。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%凝膠電泳，將陽性樣品回收后送至上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.4 nad1基因序列測定和序列分析

將所獲得的樣品測序結(jié)果用DNAStar 5.0軟件分析，并從GenBankTM上搜索現(xiàn)有的片形吸蟲nad1基因序列，進(jìn)行同源性比較。以豬蛔蟲（Ascaris suum）作為外群，利用Clustal X1.8及Mega 4.1程序中的鄰接法（Neighbor-joiningmethod，NJ）繪制種系發(fā)育樹。鄰接法在軟件默認(rèn)設(shè)置下進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)奶牛片形吸蟲流行學(xué)調(diào)查結(jié)果

通過對不同地區(qū)共240份奶牛糞便樣品的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：共有13份樣品檢測為陽性，陽性率5.41%；韓寺鎮(zhèn)、萬灘鎮(zhèn)、白沙鎮(zhèn)、大孟鎮(zhèn)4個鎮(zhèn)奶牛場奶牛片形吸蟲感染率分別為5.0%、3.30%、6.67%和6.67%。詳見表1。

表1 不同地區(qū)奶牛片形吸蟲流行學(xué)調(diào)查結(jié)果

2.2 不同發(fā)育階段奶牛片形吸蟲流行學(xué)調(diào)查結(jié)果

通過分析不同生長階段奶牛群感染片形吸蟲病的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)各生長階段奶牛群都可以感染片形吸蟲，其中以1歲以下的犢牛感染率最低，為3.12%；2歲以上的成年牛的感染率最高，為6.50%；1～2歲的奶牛感染率居中，為4.71%。詳見表2。

表2 不同年齡奶牛片形吸蟲流行學(xué)調(diào)查結(jié)果

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

13個片形吸蟲樣品成功擴(kuò)增出約440 bp的片段，與預(yù)期片形吸蟲nad1目的片段大小相符，未出現(xiàn)非特異性條帶，且空白對照為陰性，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。

圖1 片形吸蟲線粒體線粒體nad1基因序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析

2.4 測序與序列分析結(jié)果

測序結(jié)果顯示，13個片形吸蟲樣品均成功擴(kuò)增出nad1基因片段，大小基本一致，為442～446 bp，通過與GenBank中所收錄的片形吸蟲相關(guān)的nad1序列（EF612491.1、EF612492.1、EF612494.1 與 EF612496.1）進(jìn)行同源性對比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1個片形吸蟲樣品檢測為肝片吸蟲，12個樣品檢測為大片吸蟲，其中肝片吸蟲分離株nad1序列與GenBank中收錄的肝片吸蟲（EF612494.1和EF612496.1）同源性分別為98.7%和99.3%，12個大片吸蟲分離株nad1與GenBank中收錄的大片吸蟲（EF612491.1和EF612492.1）同源性分別為98.6%～99.3%和99.2%～99.8%。使用Mega 4.1軟件的鄰位相連法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建序列的種系發(fā)育樹（圖2），通過種系發(fā)育分析，結(jié)果顯示，12個片形吸蟲分離株與GenBank中收錄的大片吸蟲（EF612491.1和EF612492.1）位于同一大分支，1個片形吸蟲分離株與GenBank中收錄的肝片吸蟲（EF612494.1和EF612496.1）位于同一大分支，得到了很好的鑒別。詳見圖2。

圖2 基于nad1基因序列所構(gòu)建的自展一致樹

3 討論

本次調(diào)查結(jié)果顯示，中牟縣奶牛片形吸蟲病感染率5.41%，調(diào)查結(jié)果明顯低于湘東地區(qū)奶牛片形吸蟲病感染率（21.43%）［5］，但高于廣西地區(qū)奶牛片形吸蟲病感染率（0）［6］，這說明不同地區(qū)奶牛片形吸蟲流行情況差異較大。通過分析不同生長發(fā)育階段奶牛群片形吸蟲病感染情況，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，1歲以下犢牛的感染率最低，為3.12%，而1～2歲和2歲以上奶牛群感染率偏高，分別為4.71%和6.50%。

為了明確中牟縣奶牛片形吸蟲的種類，本次研究在對研究所獲得的13個片形吸蟲樣品分離株進(jìn)行了nad1基因序列擴(kuò)增與分析，進(jìn)行準(zhǔn)確的分子鑒定。結(jié)果顯示，擴(kuò)增所得到的13個片形吸蟲樣品分離株線粒體nad1基因序列長度基本一致，為442～446 bp，其中肝片吸蟲分離株nad1序列與GenBank中收錄的肝片吸蟲（EF612494.1和EF612496.1）同源性分別為98.7%和99.3%，12個大片吸蟲分離株nad1與GenBank中收錄的大片吸蟲（EF612491.1和EF612492.1）同源性分別為98.6%～99.3%和99.2%～99.8%，可以初步確定中牟縣奶牛片形吸蟲種類主要為肝片吸蟲和大片吸蟲，其中大片吸蟲為優(yōu)勢蟲種，通過構(gòu)建系統(tǒng)種系發(fā)育樹也確定了這一結(jié)果。本次研究對中牟縣乃至河南省奶牛片形吸蟲病的診斷和防制及進(jìn)一步分子學(xué)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

［1］ 陳芳玲，任佳麗，盧秀紅，等.間接ELISA檢測百色地區(qū)牛片形吸蟲感染情況［J］.廣西畜牧獸醫(yī)，2015，31（2）：84-86.

［2］ Valero M A，Perez-CrespoI，Periago M V，et al.Fluke egg characteristics for the diagnosisof human and animal fascioliasis by Fasciola hepatica and F.gigantica［J］.Acta Trop，2009，111（2）：50-159．

［3］ 顧偉，蘇慧勇，鄒靜，等.云南省首次暴發(fā)巨片形吸蟲感染的臨床診治分析［J］.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2012，30（6）：455-459.

［4］ 汪明.獸醫(yī)寄生蟲學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：226-234.

［5］ 何德肆，胡述光，歐陽敘向，等.湘東地區(qū)五個奶牛場寄生蟲病感染情況調(diào)查［J］.中國獸醫(yī)寄生蟲病，2004，12（1）：11-14.

［6］ 韋志峰，覃勇，陸以全，等.廣西水牛和奶牛寄生蟲感染情況的調(diào)查［J］.中國畜禽種業(yè)，2015（4）：3-5.