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        山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒的gag基因克隆及分析

        2018-05-25 06:10:45侯宏艷朱德建張丹俊胡曉苗趙瑞宏
        中國草食動物科學 2018年2期
        關鍵詞:病羊山羊鼻腔

        侯宏艷,朱德建,張丹俊,胡曉苗,趙瑞宏,戴 銀

        (安徽省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,合肥 230031)

        羊地方性鼻內(nèi)腺癌(Enzootic nasal adenocarcinoma,ENA)是由綿羊鼻內(nèi)腫瘤病毒(ENTV-1)和山羊鼻內(nèi)腫瘤病毒(ENTV-2)引起的慢性傳染病。ENA呈世界性分布,在法國、意大利、美國、日本、巴西、尼日利亞等國都有綿羊或山羊感染的報道[1-3]。山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤是由ENTV-2引起的一種慢性、進行性、接觸性傳染?。?],呈地域性流行,臨床表現(xiàn)為呼吸困難、鼻漏、鼻腔內(nèi)現(xiàn)單側或雙側增生物[4],雖然發(fā)病率不高,但病死率達100%,且發(fā)病的多為成年羊[3],給養(yǎng)殖戶造成較大的經(jīng)濟損失。近年來,在我國內(nèi)蒙古、湖南、四川、陜西[5-10]等地都有該病的報道,已逐漸引起養(yǎng)羊行業(yè)的重視。

        安徽省對該病鮮有報道,臨床上也不多見,作者在臨床上碰到的這起病例在臨床特點及病理損傷方面均與國內(nèi)外報道有高度相似性,為進一步從病原上對該病確診,本研究開展了分子生物學檢測,以便為山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病的防控提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        從發(fā)生疑似山羊鼻內(nèi)腫瘤羊場的發(fā)病羊群中選出病羊2例,剖檢后取鼻腔內(nèi)腫瘤組織,剪碎研磨后置-80℃保存?zhèn)溆?。病毒基因組RNA提取試劑盒,RT-PCR試劑盒,2×Taqmix,瓊脂糖凝膠回收試劑盒,pMD19-T Vector,質(zhì)粒提取試劑盒,DL2000Marker等均購自上海生物工程有限公司。

        1.2 臨床癥狀與剖檢病變

        在發(fā)病羊場了解周圍環(huán)境、發(fā)病情況,并沿矢狀切面打開病羊頭骨觀察病變情況。

        1.3 分子生物學檢測

        根據(jù)已發(fā)表的GenBank中的已有序列,參照郝中香等[5]的報道,設計一對gag基因部分片段的特異性引物,P1 5'-AAATGCGACCTTCCGATAATGATGA-3';P2 5'-CTTCTGTAGCGGGGACATATTCTCA-3',預期擴增目的基因片段長度323 bp,由上海生物工程有限公司合成。

        取1.1中研磨好的腫瘤組織,用病毒基因組RNA提取試劑盒提取RNA,用RT-PCR試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,具體操作按說明書進行。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行PCR擴增,PCR反應體系(25μL):2×Taqmix 12.5μL,ddH2O 8.5μL,20μM 的上下游引物各1μL,cDNA模板2μL。PCR反應條件:95℃變性4min;95℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 30 s,共 30 個循環(huán);72℃延伸10min。

        PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳,用DNA凝膠回收試劑盒對目的條帶回收純化,具體操作按說明書進行。純化后的PCR產(chǎn)物連接到pMD19-TVector,轉(zhuǎn)化TOP10。陽性克隆質(zhì)粒送上海生物工程有限公司測序,測序結果通過Blast比對。

        2 結果與分析

        2.1 流行病學和臨床癥狀

        該羊場發(fā)病羊均為1歲以上的青年羊及成年羊,先有3只發(fā)病,后又有2只發(fā)病。病羊單側有大量鼻液流出,鼻液呈灰白狀,漏的一側面部鼓起,明顯看到兩側的不同,按壓額骨變軟。

        2.2 病理變化

        沿矢狀切面打開病羊頭骨可見單側性的增生物,呈粉紅色結節(jié)狀,質(zhì)地柔軟,增生物沿鼻腔生長,使鼻腔閉塞,鼻骨變形。整個鼻腔內(nèi)充滿灰白色的糊狀物,覆蓋在增生物上(圖1)。

        2.3 gag部分基因的克隆與序列比對

        采用1.3中的引物和方法獲得gag部分基因片段,結果得到預期大小的特異性片段,大小約323 bp(圖2)。克隆測序后的基因片段與NCBI已報道的核苷酸序列比對,結果顯示,得到的序列與NCBI已報道ENTV-2核苷酸序列同源性最高,達99%,表明該病羊感染了ENTV-2。

        圖1 病羊單側鼻內(nèi)腫物

        圖2 山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒gag部分基因片段PCR擴增結果

        圖3 獲得的gag部分基因與已報道的核苷酸序列(ID:HM 104174.1)的比對

        3 討論

        ENTV-2的臨床癥狀和病理剖檢較典型,病羊出現(xiàn)鼻漏、面部腫脹,以及在鼻內(nèi)發(fā)現(xiàn)增生物可作為初期診斷的依據(jù),進一步診斷可借助特異性強、穩(wěn)定性和重復性均好的RT-PCR快速檢測方法。本研究調(diào)查了安徽省發(fā)生ENT病羊的癥狀,剖檢病羊后觀察組織病變,并進行了闡述,初步認定為山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤,另外對病原的gag部分基因片段進行了克隆和序列比對,結果與NCBI已報道ENTV-2核苷酸序列同源性最高,達99%,表明該病羊感染了ENTV-2。

        ENTV-2引起山羊鼻內(nèi)粘膜上皮細胞和肺支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化,異常增生形成腫瘤。盡管國內(nèi)外學者在病原方面(包括腫瘤發(fā)生機制及免疫應答特點等)進行了深入研究,如謝智勇等[8]對四川發(fā)生的羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒的SU基因進行了原核表達,何亞鵬等[9]對ENTV-2 Shaanxi株SU蛋白進行了原核表達及多克隆抗體的制備,王彬[10]利用生物信息學軟件分析了miRNA差異表達在腫瘤形成中的作用,但都還沒有找到有效的防控措施。針對該病主要還是應用RT-PCR方法檢測出感染的山羊,通過淘汰病羊進行羊群的凈化,并注意養(yǎng)羊場的周邊環(huán)境是否符合養(yǎng)殖要求,以避免造成長期的危害。

        [1] De Las HerasM,Ortin A,Cousens C,et al.Enzootic nasal adenocarcinoma of sheep and goats[J].Curr Top Microbiol lmmunol,2003,275(2):1-23.

        [2] Vitellozzi G,Mughetti L,Palmarini M,et al.Enzootic intranasal tumour of goats in Italy [J].Zentralbl Veterinarmed B,1993,40(7):459-468.

        [3] Kawasako K,Okamoto M,Kurosawa T,et al.Enzootic intranasal tumour virus infection in apparently healthy sheep in Japan[J].Vet Rec,2005,157(4):118-120.

        [4] 林曦,郝先譜,趙振華,等.山羊鼻內(nèi)腺瘤和腺癌的病理學研究[J].畜牧獸醫(yī)學報,1995,26(5):456-461.

        [5] 郝中香,謝智勇,廖紅,等.山羊鼻內(nèi)腫瘤病毒RT-PCR檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學,2014,44(9):933-938.

        [6] 余遠迪,韋雷飛,黃秀君,等.4例山羊鼻內(nèi)腫瘤的診斷[J].動物醫(yī)學進展,2014,35(4):129-131.

        [7] 雷紅宇,蘇建明,寧玲忠,等.一起山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤的調(diào)查宇診斷[J].動物醫(yī)學進展,2006,27(2):112-114.

        [8] 謝智勇,馬新玥,萬莉,等.羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒SU基因的克隆與原核表達[J].中國獸醫(yī)科學,2013,43(11):1175-1179.

        [9] 何亞鵬,張琪,王景,等.山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒SU蛋白的原核表達及多克隆抗體的制備[J].中國獸醫(yī)科學,2016,46(12):1563-1567.

        [10]王彬.ENTV和enENTV全基因組分析及ENA組織miRNA差異表達分析[D].雅安:四川農(nóng)業(yè)大學,2016.

        [11] Liu S L,Miller A D.Transformation of Madin-Darby canine kidney epithelial cells by sheep retrovirus envelope proteins [J].J Virol,2005,79(2):927-933.

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