夏菡 袁志明 Dennis Bente

430071武漢,中國科學(xué)院武漢病毒研究所(夏菡、袁志明)；77555加爾維斯頓,美國德州大學(xué)醫(yī)學(xué)分部微生物與免疫系(Dennis Bente)

克里米亞-剛果出血熱(Crimean-Congo hemorrhagic fever,CCHF),在我國又稱“新疆出血熱”,是一種以蜱為主要傳播媒介的烈性傳染病,病死率高達(dá)40%[1-2]。其致病原克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus,CCHFV)的基因組為3節(jié)段負(fù)鏈RNA：S基因編碼病毒核蛋白(nucleoprotein,NP),M基因編碼一個(gè)多聚蛋白(glycoprotein,GP),L基因編碼病毒RNA依賴的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)[3-4]。CCHF長期在非洲、巴爾干、中東和亞洲流行,隨著全球氣候變化、媒介蜱活動(dòng)范圍擴(kuò)大和貿(mào)易活動(dòng)增加,CCHF在我國再暴發(fā)和擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)存在[5-11]。當(dāng)前對于CCHFV致病機(jī)理和病毒媒介宿主相互作用等研究不足,且無有效的特異性藥物或疫苗,為了保障國家生物安全,需要加強(qiáng)對其研究。

NanoLuc熒光素酶(nanoluciferase)是目前性能最好的生物發(fā)光報(bào)告基因之一,大小為綠色熒光蛋白(GFP)的三分之二,亮度比螢火蟲熒光素酶(luciferase)高240倍[12]。本研究利用反向遺傳學(xué)操作方法,通過對CCHFV M節(jié)段的修飾,獲得可表達(dá)NanoLuc熒光素酶的重組CCHFV(recombinant CCHFV,rCCHFV),并使用利巴韋林和Furin抑制劑評估其用于快速藥物初篩的可行性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒、抗病毒化合物和試劑SW13細(xì)胞(比利時(shí)魯汶大學(xué)P.Leyssen教授惠贈(zèng))培養(yǎng)于含10%小牛血清、1%青霉素/鏈霉素、1 mmol/L丙酮酸鈉的DMEM培養(yǎng)基；BSR-T7/5細(xì)胞(德國慕尼黑大學(xué)K.K.Conzelmann教授惠贈(zèng)),使用含5%小牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基和含5%小牛血清、1%青霉素/鏈霉素、1 mg/ml G418的DMEM培養(yǎng)基交替培養(yǎng)；含野生型 IbAr10200 CCHFV基因的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒(pT7-S、pT7-M和 pT7-L)及表達(dá)質(zhì)粒(pC-N和pC-L opti)由美國疾病預(yù)防控制中心Bergeron Eric研究員惠贈(zèng)；pNL1.1質(zhì)粒和Nano-Glo熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司；In-Fusion克隆試劑盒和NucleoBond? Xtra質(zhì)粒提取試劑盒購自Clotech公司；利巴韋林(Ribavirin)和Furin抑制劑(Furin Inhibitor)購自 Sigma公司；TransIT-LT1轉(zhuǎn)染試劑購自Mirus公司；細(xì)胞培養(yǎng)用的血清、抗生素和DMEM培養(yǎng)基均購自Gibco公司。

1.2 研究方法

1.2.1 pT7-M-mucin_NLuc的構(gòu)建：以pNL1.1為模板,引物NL_mucin_F和 NL_mucin_R(表1)擴(kuò)增NanoLuc編碼框(約0.7 kb)；以pT7-M為模板,NL_mucin_vectorF和NL_mucin_vectorR為引物(表1)擴(kuò)增載體片段(約8.5 kb)；依據(jù)In-Fusion克隆試劑盒的說明進(jìn)行操作并涂布LB抗性(Amp 100μg/ml)平板,置于37℃培養(yǎng)箱中,12～24 h后挑取克隆；使用PCR、酶切和測序確認(rèn)陽性克隆。

表1 pT7-M-mucin_NLuc構(gòu)建所用的引物Tab.1 Sequence of primers for pT7-M-mucin_NLuc construction

1.2.2 NanoLuc rCCHFV的拯救和NanoLuc熒光素酶信號檢測：轉(zhuǎn)染前1 d,準(zhǔn)備新鮮的BSR-T7/5 6孔板(3.0×105細(xì)胞/孔)；16～24 h后,將2.5μg pT7-M-mucin_NLuc 與 1 μg pT7-S、1μg pT7-L、0.66 μg pC-N和0.33μg pC-L質(zhì)?；靹蛴?50μl Opti-MEM中,再以2.5μl/μg的比例向其中加入TransIT-LT1,混合均勻室溫放置20 min[13]；向細(xì)胞培養(yǎng)板中加入轉(zhuǎn)染復(fù)合體,放回37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)96 h；取上述BSR-T7/5細(xì)胞轉(zhuǎn)染后上清,轉(zhuǎn)移到新鮮的SW13 6孔板(1～2 ml上清/孔),放回37℃培養(yǎng)箱中；3～5 d后觀察,如出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect,CPE),則取相應(yīng)的細(xì)胞上清進(jìn)行NanoLuc發(fā)光信號檢測和TCID50測定；按照Nano-Glo熒光素酶檢測試劑盒和EnVisionTM多功能檢測儀(PerkinElmer)使用說明檢測并讀取光信號(relative light unit,RLU)。

1.2.3 評估rCCHFV用于體外抗病毒藥物高通量快速初篩的可行性：準(zhǔn)備SW13 96孔板；24 h后,棄培養(yǎng)基,每孔加入200μl利巴韋林(10μmol/L)+rCCHFV(0.01 MOI)、Furin抑制劑(10 μmol/L)+rCCHFV(0.01 MOI)、rCCHFV(0.01 MOI)或正常細(xì)胞對照(各3個(gè)復(fù)孔)；培養(yǎng)1～2 h后,棄孔中液體,PBS洗滌2次后再加入200μl含10μmol/L利巴韋林或Furin抑制劑的培養(yǎng)基或空白培養(yǎng)基,放回培養(yǎng)箱；處理后1～4 d,測定RLU值,分析比較待評估化合物對NanoLuc rCCHFV的抑制效果。

圖1 重組克里米亞-剛果出血熱病毒的設(shè)計(jì)(A)和pT7-M-Mucin_NLuc的酶切驗(yàn)證(B)Fig.1 (a)The strategy for rCCHFV construction and(b)the restriction enzyme digestion conformation for plasmid pT7-M-Mucin_NLuc

圖2 重組克里米亞-剛果出血熱病毒感染SW13細(xì)胞后產(chǎn)生的細(xì)胞病變效應(yīng)(A)和重組克里米亞-剛果出血熱現(xiàn)毒感染細(xì)胞上清中相對光單位與半數(shù)組織感染劑量(B)Fig.2 (a)Cytopathic effect caused by recombinant CCHFV in SW13 cells and(b)the RLU and TCID50 value in cell supernatant infected by recombinant CCHFV

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：相關(guān)性和ANOVA方差分析分別使用 R語言(https：//www.r-project.org/)中的Package stats version 3.2.5中的cor.test,aov和TukeyHSD分析方法完成。

2 結(jié)果

2.1 rCCHFV的設(shè)計(jì)和pT7-M-mucin_Nluc的獲得為了使NanoLuc信號的檢測更加方便,設(shè)計(jì)將NanoLuc的開放讀碼框(open reading frame,ORF)連接到mucin的ORF后,中間使用GGGS進(jìn)行連接,以減少外源基因?qū)ucin的影響,見圖1(A)。經(jīng)過PCR篩選的陽性重組質(zhì)粒使用SnaBI單酶切獲得了與預(yù)期大小一致的8.9 kb片段,使用SnaBI/XmaI雙酶切獲得了與預(yù)期大小一致的兩個(gè)片段(2.3 kb和6.6 kb),見圖1(B)。隨后測序結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)成功獲得了序列正確的pT7-M-Mucin_NLuc質(zhì)粒。

2.2 NanoLuc熒光素酶標(biāo)記的r CCHFV的基本特征成功獲得1株 NanoLuc熒光素酶標(biāo)記的rCCHFV,將其命名為 rCCHFV-mucin_NLuc。rCCHFV-mucin_NLuc感染SW13細(xì)胞的第3天,可見明顯的CPE出現(xiàn),表現(xiàn)為細(xì)胞死亡或脫落,見圖2(A)。通過對rCCHFV-mucin_NLuc感染后1～4 d細(xì)胞上清中的RLU和TCID50進(jìn)行測定,并對兩者的相關(guān)性進(jìn)行分析,結(jié)果表明RLU與TCID50呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)cor=0.998,P=0.001。

2.3 用于抗病毒藥物高通量快速初篩的可行性評估每次取微量細(xì)胞上清(10μl)進(jìn)行NanoLuc熒光素酶信號RLU測定,耗時(shí)＜5 min,RLU值越低,表明藥物對病毒的抑制效果越好。未經(jīng)過處理的rCCHFV感染孔,RLU值于感染后第3或4天達(dá)到峰值,在10μmol/L濃度下,Furin抑制劑處理后第1天到第3天,感染細(xì)胞上清中RLU值與利巴韋林處理組無顯著差異(P＞0.1),但在第4天,Fruin抑制劑處理組的RLU值顯著高于利巴韋林處理組(P=0.001),且與未處理病毒對照組無明顯差異(P＞0.1)(圖3和表2)。因此,初篩結(jié)果表明Furin抑制劑不適合作為CCHFV的抗病毒藥物。

圖3 利巴韋林和Furin抑制劑處理后重組克里米亞-剛果出血熱病毒的相對光單位Fig.3 The RLU value for rCCHFV after Ribvirin or Furin inhibitor treatment

表2 利巴韋林和Furin抑制劑處理后組間相對光單位的方差分析Tab.2 The ANOVA analysis for the relative light unit value after treated by Ribavirin or Furin inhibitor

3 討論

CCHFV反向遺傳系統(tǒng)的建立難度極大,直到2015年其全病毒拯救系統(tǒng)才由Bergeron等成功建立[13-15]。目前帶報(bào)告基因的重組病毒已被廣泛用于抗病毒藥物篩選、病毒復(fù)制、病毒入侵和活體成像等研究。NanoLuc基因分子量非常小,可以最大限度減少外源基因?qū)Σ《镜母蓴_,目前已成功用于多種重組病毒的構(gòu)建,例如NanoLuc重組流感病毒、辛德畢斯病毒和基孔肯雅病毒、乙型肝炎病毒和狂犬病病毒用于藥物篩選、活體成像、病毒生物特性等研究[16-19]。CCHFV感染細(xì)胞后,mucin蛋白大量分泌到胞外,本研究成功將NanoLuc基因整合其mucin編碼框后,獲得帶NanoLuc標(biāo)記的rCCHFV。該重組病毒在感染SW13細(xì)胞后的3～4 d滴度達(dá)峰值,且可以將NanoLuc分泌到胞外,因此不需要裂解僅從細(xì)胞上清中取樣即可測定RLU值。同時(shí)RLU值與TCID50呈高度正相關(guān),可以實(shí)時(shí)反映病毒的增殖狀況,且耗時(shí)極短。該方法也存在不足,NanoLuc檢測試劑加入后需要在30 min內(nèi)完成測定過程,否則存在信號衰減而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

已有報(bào)道表明利巴韋林在體外可抑制CCHFV復(fù)制,本研究以利巴韋林為陽性對照,Furin抑制劑作為候選化合物,快速測定其體外對重組病毒的抑制作用。初篩結(jié)果表明,利巴韋林與已報(bào)道的結(jié)果一致,對CCHFV體外復(fù)制具有抑制作用,但是Furin抑制劑的效果差于利巴韋林,不適合作為CCHFV的抗病毒候選藥物繼續(xù)進(jìn)行深入的評估。在藥物濃度為10μmol/L條件下,陽性藥物利巴韋林處理后1～4 d,RLU值和未處理對照組相比降低約2個(gè)數(shù)量級,具有顯著差異。而Furin抑制劑處理組盡管在處理后1～3 d RLU值與利巴韋林處理組無明顯差異,但是在處理后第4天RLU值顯著高于利巴韋林處理組(P≤0.01),且與未處理組無顯著差異(P＞0.1)。Furin蛋白酶在促進(jìn) mucin蛋白分泌到胞外過程起到作用,這可能是Furin抑制劑處理后一段時(shí)間內(nèi)感染上清中RLU值有所降低的原因之一。今后的研究中,可以利用本重組病毒,對大量的待評估藥物進(jìn)行快速初步篩選,縮小目標(biāo)范圍,為抗CCHFV藥物的研發(fā)提供技術(shù)支持。

利益沖突無