霍湘蕓，蔣耀瑛，王歲樓

（中國藥科大學(xué)工學(xué)院，江蘇南京 211198）

0 引言

葉綠素在自然界中普遍存在，有許多生物活性和生物功能，能降低膽固醇、抗衰老、排毒消炎，具有抗癌抗突變、抗貧血、保肝等功能[1]。紅葉石楠作為一種觀賞植物，常用于園林綠化，目前尚無其他用途。據(jù)介紹，石楠葉中含有多種活性物質(zhì)，目前已從中提取出了熊果酸、齊墩果酸[2-3]、黃酮類化合物、綠色素類，但對(duì)于其品種之一的紅葉石楠，還沒有提取葉綠素等功能性色素的報(bào)道。對(duì)紅葉石楠葉綠素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行了初步研究，旨在為其開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石楠葉：新鮮紅葉石楠葉片，2017年5月采摘于中國藥科大學(xué)江寧校區(qū)食堂門口。選擇顏色鮮亮、形狀完整的葉片，洗凈、瀝干水分，于40℃烘箱中烘干，恒質(zhì)量后真空干燥1 h，取出粉碎后過100目篩，避光保存。

主要試劑：丙酮、石油醚、無水乙醇、氧化鋁、焦性沒食子酸、七水合硫酸亞鐵、水楊酸、30%過氧化氫、硅藻土等，均為分析純?cè)噭?；柱層析硅膠，100～200目。

主要儀器：DZF-6050型真空干燥箱、DFY-500型高速中藥粉碎機(jī)、TU-1810型紫外-可見分光光度計(jì)、TGL-16G型高速臺(tái)式離心機(jī)、KH-100B型超聲儀、HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋、RE-4205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器等，均為國產(chǎn)儀器；DV215CD型電子天平、OHAUS CORPORATION，美國產(chǎn)品。

1.2 葉綠素的提取

準(zhǔn)確稱取1 g鮮綠石楠葉子粉末，以一定料液比加入提取溶劑，在一定溫度下提取一定時(shí)間，抽濾得濾液即為粗提液。

（1）料液比的影響。丙酮為溶劑，分別稱取粉末1.0 g于試管中，提取溫度45℃，提取時(shí)間2 h，在料液比1∶6，1∶8，1∶10，1∶12條件下暗處密封提取。于波長645，663 nm處測定吸光度。

（2） 提取溶劑的影響。選用95%乙醇、丙酮及石油醚，80%丙酮∶石油醚（1∶1），丙酮∶乙醇∶水（4.5∶4.5∶1），乙醇∶丙酮（1∶1），95%乙醇∶80%丙酮（1∶1），80%丙酮為溶劑，分別稱取粉末1.0 g于試管中，料液比1∶10，溫度45℃，暗處密封放置2 h提取。于波長645，663 nm處測定吸光度。

（3）提取溫度的影響。丙酮為溶劑，分別稱取粉末1.0 g于試管中，料液比1∶10，提取時(shí)間2 h，分別在溫度30，40，45，50，55℃下暗處密封提取。于波長645，663 nm處測定吸光度。

（4）提取時(shí)間的影響。丙酮為溶劑，分別稱取粉末1.0 g于試管中，料液比1∶10，提取溫度50℃，暗處密封放置1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h提取。于波長645，663 nm處測定吸光度。

1.3 葉綠素的分離純化

選用一定吸附劑和洗脫劑濕法裝柱，加入1 mL葉綠素粗提液，用一定洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集色素液，測定吸光度。

（1） 最佳吸附劑的選擇。分別稱取15 g硅膠、硅藻土、氧化鋁、硅膠∶硅藻土=1∶1、硅膠∶硅藻土=2∶1、硅藻土∶硅膠=2∶1吸附劑，濕法裝柱，加入1 mL葉綠素粗提液，用洗脫劑（石油醚∶丙酮=2∶1）進(jìn)行洗脫，收集色素液，于波長645，663 nm處測定吸光度。

（2） 最佳洗脫劑的選擇。稱取5份15 g硅藻土，分別用石油醚∶丙酮=4∶1，10∶3，7∶3，2∶1，5∶3濕法裝柱，加入1 mL葉綠素粗提液，用洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集色素液，于波長645，663 nm處測定吸光度。

（3） 最佳吸附劑質(zhì)量的選擇。分別稱取10.0，15.0，17.5，20.0，25.0 g不同質(zhì)量的硅藻土，用洗脫劑（石油醚∶丙酮=2∶1） 濕法裝柱，用洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集色素液，于波長645，663 nm處測定吸光度。

（4）分離純化的正交試驗(yàn)。紅葉石楠葉綠色素分離的正交試驗(yàn)采用三因素三水平L9（34）的設(shè)計(jì)方法。

分離純化正交試驗(yàn)的因素及水平見表1。

表1 分離純化正交試驗(yàn)的因素及水平

1.4 葉綠素含量的測定

于波長645，663 nm處測定粗提液或純化液的吸光度。根據(jù)Arnon公式計(jì)算葉綠素a和葉綠素b的質(zhì)量濃度（mg/L），乘以相應(yīng)體積數(shù)，計(jì)算每1 mL樣品葉綠素質(zhì)量（μg/mL）。

式中：V——定容后樣品體積，mL；

n——稀釋倍數(shù)；

W——紅葉石楠葉片粉末質(zhì)量，g。

1.5 體外抗氧化活性考查

（1） 清除·OH的能力。配制反應(yīng)體系溶液（9mmol/L硫酸亞鐵1 mL，9 mmol/L乙醇-水楊酸1 mL，0.003%H2O21 mL），加入上述方法純化后的葉綠素提取液，蒸餾水作參比，以空白試劑為對(duì)照，于波長510 nm處測定吸光度。

（2） 清除O2-·的能力。將3 mmol/L鄰苯三酚溶液與50 mmol/L Tris-HCl緩沖液和上述純化后的葉綠素提取液混合，以蒸餾水為參比溶液，10 mmol/L的HCl溶液作對(duì)照，于波長325 nm處每隔30 s測定吸光度。按以下公式計(jì)算O2-·清除率。

式中：ΔA1/Δt——鄰苯三酚自氧化反應(yīng)速率；

ΔA2/Δt——加入色素樣液后鄰苯三酚自氧化反應(yīng)速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅葉石楠葉綠素的提取效果

料液比對(duì)紅葉石楠葉綠素提取效果的影響見圖1，提取溶劑對(duì)紅葉石楠葉綠素提取效果的影響見圖2，提取溫度對(duì)紅葉石楠葉綠素提取效果的影響見圖3，提取時(shí)間對(duì)紅葉石楠葉綠素提取效果的影響見圖4。

圖1 料液比對(duì)紅葉石楠葉綠素提取效果的影響

圖2 提取溶劑對(duì)紅葉石楠葉綠素提取效果的影響

圖3 提取溫度對(duì)紅葉石楠葉綠素提取效果的影響

圖4 提取時(shí)間對(duì)紅葉石楠葉綠素提取效果的影響

從圖1可知，在料液比1∶10時(shí)，葉綠素總含量最高，葉綠素提取效果最好；從圖2可知，最佳提取溶劑為丙酮，此時(shí)葉綠素含量達(dá)到最大值，葉綠素提取效果最佳；從圖3可知，隨著提取溫度升高，葉綠素含量逐漸增加，但提取溫度高于45℃時(shí)，葉綠素含量逐漸減少；從圖4可知，隨著提取時(shí)間增加，葉綠素含量逐漸提高，但提取時(shí)間超過2 h，葉綠素含量逐漸減少。

按以上單因素試驗(yàn)選定的最優(yōu)提取工藝條件（丙酮為提取溶劑，料液比1∶10，提取溫度45℃，提取時(shí)間2 h）進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明粗提液葉綠素含量平均值可達(dá)16.42μg/mL，換算成原料石楠葉提取率約為10.26 mg/g。

2.2 紅葉石楠葉綠素的分離純化

吸附劑種類對(duì)葉綠素總含量的影響見圖5，洗脫劑種類對(duì)葉綠素總含量的影響見圖6，吸附劑質(zhì)量對(duì)葉綠素總含量的影響見圖7。

圖5 吸附劑種類對(duì)葉綠素總含量的影響

圖6 洗脫劑種類對(duì)葉綠素總含量的影響

圖7 吸附劑質(zhì)量對(duì)葉綠素總含量的影響

從圖5可知，最佳吸附劑為硅藻土，此時(shí)葉綠素總含量達(dá)到最大值，葉綠素分離純化效果最佳；從圖6可知，洗脫劑為石油醚∶丙酮=2∶1的分離純化效果最好；從圖7可知，吸附劑硅藻土質(zhì)量為15 g時(shí)，分離純化效果最好。

L9（34）分離純化正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可知，比較極差R大小，可知各因素影響次序依次為吸附劑質(zhì)量、洗脫劑比例、吸附劑種類；比較同一因素不同水平的結(jié)果，可知最優(yōu)條件組合是A1B3C3，此理論組合正好與正交試驗(yàn)中3號(hào)試驗(yàn)的條件組合一致，因此可以確定最佳分離純化方案為葉綠素提取液1 mL，硅藻土17.5 g，石油醚∶丙酮為4∶1。

表2 L9（34）分離純化正交試驗(yàn)結(jié)果

此時(shí)純化倍數(shù)=99.44/16.42=6.06

式中：99.44——純化前樣品中葉綠素總含量，μg/mL；

16.42 ——純化后樣品中葉綠素總含量，μg/mL。

2.3 體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

葉綠素清除·OH的速率見圖8，不同質(zhì)量濃度葉綠素清除O2-·的能力見圖9。

圖8 葉綠素清除·OH的速率

圖9 不同質(zhì)量濃度葉綠素清除O 2-·的能力

從圖8可知，在一定體積內(nèi)，隨著葉綠素濃度的增加，其清除·OH能力先減弱后增強(qiáng)，當(dāng)葉綠素達(dá)到一定濃度后，其清除·OH能力才會(huì)逐步增強(qiáng)；從圖9可知，隨著葉綠素質(zhì)量濃度的增加，對(duì)O2-·的清除能力也在逐漸增強(qiáng)。

3 結(jié)論

（1）石楠葉綠素提取的最佳工藝條件為葉片粉碎度100目，以丙酮為提取溶劑，料液比1∶10，提取溫度45℃，提取時(shí)間2 h，此時(shí)葉綠素提取率平均值達(dá)10.26 mg/g。

（2）石楠葉綠素粗提液分離純化的最佳工藝條件為硅藻土17.5 g，加1 mL提取液，用石油醚∶丙酮為4∶1進(jìn)行洗脫，此時(shí)純化倍數(shù)可達(dá)6.06。

（3） 對(duì)·OH，O2-·的體外清除能力表明，紅葉石楠葉綠素具有抗氧化活性。

從紅葉石楠提取葉綠素具有一定的可行性和應(yīng)用前景，其提取工藝條件及其抗氧化活性值得進(jìn)一步研究探索。

參考文獻(xiàn)：

[1]關(guān)錦毅，郝再彬，張達(dá)，等.葉綠素提取與檢測及生物學(xué)功效的研究進(jìn)展 [J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40（12）：130-134.

[2]田麗婷，馬龍，堵年生.齊墩果酸的藥理作用研究概況 [J].中國中藥雜志，2002（12）：9-11，26.

[3]王鵬，張忠義，吳忠.熊果酸在藥用植物中的分布及藥理作用 [J].中藥材，2000（11）：717-722.◇