趙晟昊 李 彤 王 凡

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 衛(wèi)輝 453100

目前腦卒中已是中老年人的常見病與多發(fā)疾病，也是我國居民的第一大死亡原因以及首位致殘因素[1-2]。腦動脈粥樣硬化(cerebral atherosclerosis，CAS)是缺血性腦血管病的首要誘發(fā)因素，尤其彌漫性的小血管病變類型，目前無有效的治療辦法[3-4]。為多發(fā)性、彌漫性CAS所致的腦缺血尋找一個有效的治療方法，以改變目前治療方法少且效果差的現(xiàn)狀，目前想到的是改變血運情況，但如何重建有效的血供是值得廣大醫(yī)學(xué)工作者深思的問題[5-6]，從而為解決老齡化社會癡呆和腦梗死預(yù)防的難題打下基礎(chǔ)。自從“基因治療使心臟生成新血管”被列為美國心臟學(xué)會1998年度公布的十大研究項目之首，促血管生長細胞因子促血管新生的研究便成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點[7-8]。從2005年至今，《Nature》《Science》《Cell》等有關(guān)腦血管形成的分子機制研究始終引領(lǐng)本學(xué)科的前沿領(lǐng)域。諸多相關(guān)基因的功能與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制在胚胎腦血管發(fā)生中的發(fā)現(xiàn)，為成年腦血管新生機制的研究奠定了理論基礎(chǔ)[9]。Ad-HGF目前已經(jīng)進入臨床Ⅲ期試驗，并在心肌缺血和骨骼肌缺血治療并獲良好評價，目前，與HGF關(guān)系密切并具有明確相互作用的是TGF-β1[10-11]。

本實驗通過向老齡CAS大鼠蛛網(wǎng)膜下腔中注入外源性Ad-HGF，觀察其促腦血管新生的作用，采用ELISA法分析CAS大鼠腦脊液中HGF和TGF-β1含量，采用免疫組化和免疫印跡法分析腦組織中HGF和TGF-β1含量，探討HGF、TGF-β1相互間作用關(guān)系與大鼠老齡和CAS的相關(guān)性。

1 材料和方法

1．1主要材料Ad-HGF(攜帶人HGF基因的重組腺病毒，滴度為5×109pfu/100 μL，北京奧洛英)，Westernblot試劑盒(碧云天)，鼠抗HGF單克隆抗體，鼠抗TGF-β1單克隆抗體，Western blot試劑盒，人HGF及鼠TGF-β1的ELISA檢測試劑盒(南京森貝伽)，膽固醇、膽酸鈉、丙基硫氧嘧啶、豬油、蛋黃粉、蔗糖(北京索萊寶)，手術(shù)顯微鏡，大鼠腦立體定位儀，微型手持式顱鉆，25 μL微量注射器，ML125鼠尾無創(chuàng)血壓測定儀，Powerlab生理信號采集與處理系統(tǒng)(Powerlab/8SP Australia)，奧林帕斯AU2700全自動生化分析儀。

1．2動物模型建立SPF級18月齡雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量300～400 g，購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[動物生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2012-0001，實驗動物設(shè)施使用許可證：SYXK(豫)2014-0005]，隨機分為對照組(n=15)和腦動脈硬化模型組(CAS，n=15)。采用高血壓合并高脂飼料喂養(yǎng)制備腦動脈硬化動物模型，造模方法按有關(guān)文獻[12]處理，造模處理后凡血壓較處理前高20 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)以上且高于115 mmHg認為形成高血壓模型[13]。大鼠喂養(yǎng)16周后，模型組TC、TG、LDL-C水平均明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。模型組隨機取大鼠5只，常規(guī)腹腔麻醉后，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液經(jīng)心臟灌注后，斷頭取頸內(nèi)動脈終段(約0.5 cm)，制成石蠟切片并進行HE染色，光鏡下觀察頸內(nèi)動脈血管病變。頸內(nèi)血管形態(tài)學(xué)觀察到血管內(nèi)皮表面粗糙凹凸不平，細胞排列不規(guī)整，大量泡沫細胞堆積，血管內(nèi)膜增厚顯著，形成典型的AS斑快，提示CAS造模成功。

1．3藥物處理建模成功后，另用40只造模大鼠隨機分為模型組、模型Ad-HGF組各20只；模型Ad-HGF組20只大鼠5×109pfu/mL，0.05 mL的Ad-HGF經(jīng)小腦延髓池注射入蛛網(wǎng)膜下腔中。模型組大鼠20只，經(jīng)小腦延髓池注入蛛網(wǎng)膜下腔注射0.05 mL生理鹽水。1月齡雄性SD大鼠40只，隨機抽取20只經(jīng)小腦延髓池注入蛛網(wǎng)膜下腔中，注射5×109pfu/mL，0.05 mL Ad-HGF。另取40只1月齡大鼠，隨機抽取20只經(jīng)小腦延髓池注入蛛網(wǎng)膜下腔5×109pfu/mL，0.05 mL Ad-HGF，另外20只經(jīng)小腦延髓池至蛛網(wǎng)膜下腔注射0.05 mL生理鹽水。6月齡雄性SD大鼠40只，隨機抽取20只經(jīng)小腦延髓池注入蛛網(wǎng)膜下腔注射5×109pfu/mL，0.05 mL Ad-HGF，另外20只經(jīng)小腦延髓池注入蛛網(wǎng)膜下腔0.05 mL生理鹽水。12月齡雄性SD大鼠40只，隨機抽取20只經(jīng)小腦延髓池至蛛網(wǎng)膜下腔注射5×109pfu/mL，0.05 mL Ad-HGF，另外20只經(jīng)小腦延髓池注入蛛網(wǎng)膜下腔0.05 mL生理鹽水。

1．4 實驗方法

1．4．1 ELISA法測定腦脊液中HGF和TGF-β1濃度

1．4．1．1 腦脊液的采集：將大鼠麻醉后，再將頭部固定于立體定位儀上，頭頸部剃毛、消毒干凈后，用手術(shù)刀在后頸部作一3 cm縱向切口，輕輕分離頸部背側(cè)的肌肉。術(shù)中及時止血，在暴露出枕骨大孔后。將大鼠頭部壓低，垂直由枕骨大孔向內(nèi)進針抽取腦脊液，注意勿插入過深。抽完后縫好里面肌肉及外面皮膚，用干凈紗布包扎傷口，防止感染。采集腦脊液后，應(yīng)注入等量的生理鹽水，以維持原有顱內(nèi)的壓力。最后將腦脊液移入1.5 mL的EP管中，放入液氮或干冰中迅速冷凍后移入-80 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4．1．2 ELISA檢測實驗步驟：依試劑盒所提供的方法，嚴格進行ELISA檢測。配置2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25 pg/mL的標(biāo)準品各0.1 mL，每孔加入100 μL標(biāo)準品或待測腦脊液。另設(shè)零孔2個，酶標(biāo)板加上蓋，37 ℃反應(yīng)90 min。反應(yīng)后用力甩盡酶標(biāo)板內(nèi)液體，再對著吸水紙拍幾下，不洗。將準備好的生物素一抗工作液以每孔0.1 mL的標(biāo)準依次加入(TMB空白顯色孔除外)孔內(nèi)，溫箱內(nèi)37 ℃下反應(yīng)60 min。然后用PBS液洗滌酶標(biāo)板3次，每次浸泡1 min以上。再用試劑盒中的ABC工作液按每孔0.1 mL的標(biāo)準依次加入(TMB空白顯色孔除外)各孔中，溫箱內(nèi)37 ℃下反應(yīng)30 min，然后重復(fù)前面洗板工作。最后每孔依次加入等量的TMB顯色液，溫箱內(nèi)37 ℃下避光反應(yīng)30 min。最后每孔依次加入TMB終止液1滴并混勻，用酶標(biāo)儀在450 nm處測吸光值OD。結(jié)果計算與判斷：以零孔為對照，測得的數(shù)據(jù)以吸光值OD作為縱坐標(biāo)，以濃度作為橫坐標(biāo)，在電腦中繪制出標(biāo)準曲線，計算樣品含量。

1．4．2 Western印跡檢測：取-80 ℃冰箱內(nèi)保存的各組大鼠的腦皮質(zhì)，每組80 mg，用液氮研磨后分別加入蛋白裂解液后離心、取上清液，BCA法測定各組蛋白質(zhì)濃度，每個樣品上樣80 μg，按總的蛋白質(zhì)量計算各樣品所需體積，需配平體積，再加入3倍Buffer煮沸5 min。再用10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后加入HGF或TGF-β1一抗，一抗?jié)舛染鶠?：1 000，在4 ℃下孵育過夜。第2天室溫下復(fù)溫60 min，用TBST洗膜3次，每次10 min以后，加入對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(濃度均為1：2 000)，室溫搖床上孵育2 h，再加入DAB顯色液在凝膠成像系統(tǒng)中進行曝光和圖像分析，用Image Q軟件分析蛋白質(zhì)條帶，并計算出各個條帶的面積與灰度值大小，計算二者乘積為積分灰度值，取3次重復(fù)測定值的均數(shù)。

1．4．3 觀察指標(biāo)：采用ELISA法測定各組大鼠腦脊液中HGF、TGF-β1的動態(tài)變化。采用Western blotting測定各組大鼠腦組織中HGF、TGF-β1蛋白雜交條帶，與內(nèi)參進行相對密度掃描求OD值。

1．5統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，對于符合方差分析應(yīng)用條件的，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用最小顯著性差異(LSD)檢驗；不滿足方差分析條件時，組間多重比較采用Dunnett’s T3檢驗。假設(shè)檢驗統(tǒng)一使用雙側(cè)檢驗，以α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1腦脊液中HGF、TGF-β1濃度未打入Ad-HGF組大鼠腦脊液中均未檢測到HGF，打入Ad-HGF組可在腦脊液中可檢測到HGF濃度。經(jīng)Dunnett’s T3法組間多重比較，打入Ad-HGF組腦脊液HGF濃度值均高于未打入Ad-HGF組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，腦脊液HGF濃度值隨年齡增加而降低，腦脊液HGF濃度值未打入Ad-HGF組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，打入Ad-HGF組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同時間點各組大鼠腦脊液HGF濃度比較

經(jīng)Dunnett’s T3法組間多重比較，打入Ad-HGF的組別腦脊液TGF-β1濃度值均高于未打入Ad-HGF的組別，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；腦脊液TGF-β1濃度值隨年齡增加而增加，各組內(nèi)不同時間比較，經(jīng)one way ANOVA分析，未打入Ad-HGF的組別腦脊液TGF-β1濃度值隨時間變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義，3個年齡Ad-HGF組腦脊液TGF-β1濃度值隨時間變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義，經(jīng)LSD法組間多重比較，TGF-β1濃度第20天組低于第10天和第30天組(表2)。

表2 不同時間點各組大鼠腦脊液TGF-β1濃度比較

2．2 Western blotting法檢測腦組織HGF、TGF-β1蛋白表達未打入Ad-HGF的組別大鼠腦組織中只有較少HGF表達，打入Ad-HGF的組別腦組織可見HGF表達增多，同一時間點打入Ad-HGF的組別均較未打入Ad-HGF的組別有明顯增加。經(jīng)Dunnett’s T3法組間多重比較，未打入Ad-HGF的模型組HGF OD值高于未打入Ad-HGF的增齡組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。打入Ad-HGF的增齡組HGF值隨年齡增加而降低，經(jīng)LSD法組間多重比較，第20天組高于第10天和第30天組(圖1，表3)。

未打入Ad-HGF增齡組大鼠腦組織中TGF-β1表達較少，但在未打入Ad-HGF的模型組大鼠腦組織中TGF-β1明顯增加。打入Ad-HGF組腦組織可見TGF-β1表達減少。TGF-β1 OD值隨年齡的增加呈正相關(guān)(表4)。各組內(nèi)不同時間之間比較，經(jīng)one way ANOVA分析，未打入Ad-HGF增齡組大鼠腦組織中TGF-β1 OD值隨時間變化無差異，未打入Ad-HGF的模型組和3個年齡Ad-HGF組腦組織中TGF-β1 OD值隨時間變化有差異，經(jīng)LSD法組間多重比較，第20天組低于第10天和第30天組(P<0.05，圖2，表4)。

表3 不同時間點各組大鼠腦組織中HGF OD值比較

表4 不同時間點各組大鼠腦組織中TGF-β1 OD值比較

圖1 Western blotting HGF蛋白表達 A：1月組；B：6月組；C：12月組；D：1月Ad-HGF組；E：6月Ad-HGF組；F：12月Ad-HGF組；G：模型組；H：模型Ad-HGF組

圖2 Western blotting TGF-β1蛋白表達 A：1月組；B：6月組；C：12月組；D：1月Ad-HGF組；E：6月Ad-HGF組；F：12月Ad-HGF組；G：模型組；H：模型Ad-HGF組

3 討論

本實驗將外源性HGF打入3組增齡大鼠組，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加，HGF水平逐漸降低，隨年齡增加，TGF-β1水平逐漸升高。而將外源性HGF打入老齡腦動脈粥樣硬化模型大鼠后，隨著動脈硬化程度加深，機體內(nèi)HGF水平逐漸增加，TGF-β1水平卻逐漸降低。說明HGF與動脈硬化程度呈正相關(guān)，與年齡呈負相關(guān)，TGF-β1與動脈硬化程度呈負相關(guān)，與年齡呈正相關(guān)。HGF、TGF-β1水平隨年齡變化呈動態(tài)互逆平衡，HGF、TGF-β1水平隨腦動脈硬化程度呈動態(tài)互逆平衡。

HGF 的快速誘導(dǎo)表達在遙遠的完整器官中很常見，如肝、腎、肺、脾，以及在受傷在大鼠缺血再灌注損傷后的心及大腦中[14]，表明內(nèi)源性HGF可能來自這些器官。在肝、腎損傷大鼠血漿中，也有體液因子誘導(dǎo)HGF的表達[15]。轉(zhuǎn)化生長因子β1可以由急性和慢性腦損傷引起，包括卒中、外傷、癲癇、多發(fā)性硬化癥和阿爾茨海默病[16]。轉(zhuǎn)化生長因子β1在不同類型的腦損傷中表達是不一樣的，不同類型腦損傷時，TGF-β1有不同對應(yīng)：卒中時TGF-β1的mRNA至少升高1周以上，明確發(fā)揮保護神經(jīng)細胞的作用[17]。有文獻報道，卒中時TGF-β1過度表達[18-20]；當(dāng)TGFβ信號被阻斷，缺血損害加劇[21]。因此，它可能是一種有效的卒中治療劑。

HGF、TGF-β1之間相互的平衡，參與確定的慢性器官疾病的預(yù)后，如腦梗死、肝硬化、腎硬化和肺纖維化[22-23]。在慢性疾病的早期階段，HGF生產(chǎn)增強抑制TGF-β1產(chǎn)生。一般來說，HGF只在細胞再生和抗肝纖維化事件中作為代償反應(yīng)發(fā)生[24-25]。相比之下，在晚期TGF-β1表達的上調(diào)抑制HGF的表達[26]。在TGF-β1占主導(dǎo)地位的條件下，容易導(dǎo)致器官纖維化的發(fā)生和器官發(fā)展為功能障礙。為扭轉(zhuǎn)這種不利的平衡，根據(jù)這種發(fā)病機制，所以用HGF治療器官的功能衰竭以及纖維化(及增生)應(yīng)視為一種新策略[27-29]。

本實驗通過建立增齡及動脈硬化模型大鼠實驗，探討了腦組織和腦脊液中HGF和TGF-β1含量變化與年齡以及動脈硬化的關(guān)系，初步顯示HGF-TGF-β1平衡在老齡以及腦動脈硬化發(fā)生、發(fā)展中的神經(jīng)保護和血管形成過程中的作用，明確外源性Ad-HGF應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的有效性和不良反應(yīng)。本實驗對Ad-HGF應(yīng)用于腦動脈硬化臨床提供了科學(xué)依據(jù)，對腦血管病的防治提供了一種新的治療方法和研究方向，也為神經(jīng)康復(fù)治療提供一個新途徑。

[1] SHEN C Y，TANG L C，LI Y T．Epidemiological investigation and risk factors of cerebral apoplexy in young and middle-aged population in western Guangdong[J]．J Guangdong Med Coll，2015，4：42-44．

[2] LUO J，HO P P，BUCKWALTER M S，et al．Glia-dependent TGF-beta signaling，acting independently of the TH17 pathway，is critical for initiation of murine autoimmune encephalomyelitis[J]．J Clin Invest，2007，117(11)：3 306-3 315．

[3] TOMIC G，STOJANOVIC M，PAVLOVIC A．Speech and language disorders secondary to diffuse subcortical vascular lesion：Neurolinguistic and acoustic analysis．A case report[J]．J Neurologic Sci，2009，283(1/2)：163-169．

[4] POORTHUIS M H F，LGRAAM M D，ALGRA A，et al．Female-and Male-Specific Risk Factors for Stroke A Systematic Review and Meta-analysis[J]．JAMA Neurol，2017，74(1)：75-81．

[5] CARR K R，ZUCKERMAN S L，MOCCO J，et al．Inflammation，Cerebral Vasospasm，and Evolving Theories of Delayed Cerebral Ischemia[J]．Neurol Res Int，2013，6：12．

[6] LI M，PENG T，SHI X，et al．Applied anatomic study and three-dimension reconstruction of the blood supply of pancreatic head[J]．Chin J Clin Anat，2014，8：15-17．

[7] SHIMAMURA M，NAKAGAMI H，TANIYAMA Y，et al．Gene therapy for peripheral arterial disease[J]．Exp Opin Biol Ther，2014，14(8)：1 175-1 184．

[8] KAMINSKY S M，ROSENGARTT K，ROSENBERG J，et al．Gene Therapy to Stimulate Angiogenesis to Treat Diffuse Coronary Artery Disease[J]．Human Gene Ther，2013，24(11)：948-963．

[9] CARMELIET P，JAIN R K．Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis[J]．Nature，2011，473(7 347)：298-307．

[10] NAKAMURA T，MIZUNO S．The discovery of hepatocyte growth factor (HGF) and its significance for cell biology，life sciences and clinical medicine[J]．Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci，2010，86(6)：588-610．

[11] MULLEN A C，ORLANDO D A，NEWMAN J J，et al．Master transcription factors determine cell-type-specific responses to TGF-β signaling[J]．Cell，2011，147(3)：565-576．

[12] 申冠洋，宋志秀，常利，等．肝細胞生長因子、TGF-β1含量與腦動脈粥樣硬化程度關(guān)系[J]．中國動脈硬化雜志，2014，22(3)：269-273．

[13] 藥紅梅，呂吉元．幾種冠狀動脈粥樣硬化大鼠模型建立方法比較[J]．中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2011，4(9)：450-451．

[14] YILDIZ Y，SOKMENSUER C，YALCIN S．Evaluation of c-Met，HGF，and HER-2 expressions in gastric carcinoma and their association with other clinicopathological factors[J]．Onco Targets Ther，2016，9：5 809-5 817．

[15] COTA B D C V，LIMA K S，MORAD A M．Expression of the c-MET，HGF and VEGF biomarkers in intes-tinal and diffuse gastric cancer in the Brazilian population：a pilot study for the standardization of the quantitative PCR technique[J]．Appl Cancer Res，2017，37(1)：18．

[16] BUCKWALTER M，WYSS-CORAY T．Modelling neu-roinflammatory phenotypes invivo[J]．J Neuroinflammation，2004，1：10．

[17] SUGIMOTO K，NISHIOKA R，IKEDA A，et al．Activated microglia in a rat stroke model express NG2 proteoglycan in peri-infarct tissue through the involvement of TGF-β1[J]．Glia，2014，62(2)：185．

[18] BUISSON A，LESNE S，DOCAGNE F，et al．Transforming growth factor-beta and ischemic brain injury[J]．Cell Mol Neurobiol，2003，23(4/5)：539-550．

[19] WANG S，YIN J，GE M，et al．Transforming growth-beta 1 contributes to isoflurane postconditioning against cerebral ischemia-reperfusion injury by regulating the c-Jun N-terminal kinase signaling pathway[J]．Biomed Pharmacother，2016，78(2)：280-290．

[20] MA M，MA Y，YI X，et al．Intranasal delivery of transforming growth factor-beta 1 in mice after stroke reduces infarct volume and increases neurogenesis in the subventricular zone[J]．BMC Neurosci，2008，9：117．

[21] YOO S W，CHANG D Y，LEE H S，et al．Immune following suppression mesenchymal stem cell transplantation in the ischemic brain is mediated by TGF-β[J]．Neurobiol Dis，2013，58：249-257．

[22] MIZUNO S，MATSUMOTO K，NAKAMURA T，et al．Hepatocyte growth factor suppresses interstitial fibrosis in a mouse model of obstructive enephropathy[J]．Kidney Int，2001，59(4)：1 304-1 314．

[23] GIEBELER A，BOEKSCHOTEN M V，KLEIN C，et al．c-Meconfers protection against chronic liver tissue damage and fibrosis progression after bile duct ligation in mice[J]．Gastroenterology，2009，137(1)：297-308．

[24] LIN Y，F(xiàn)ANG Z P，LIU H J，et al．HGF/R-spondin1 rescues liver dysfunction through the induction of Lgr5+ liver stem cells[J]．Nature Commun，2017，8(1)：1 175．

[25] ISHIKAWA T，F(xiàn)ACTOR V M，MARQUARDT J U，et al．Hepatocyte Growth Factor(HGF)/c-Met Signaling is required for Stem Cell Mediated Liver Regeneration[J]．Hepatology，2012，55(4)：1 215-1 226．

[26] BYE N，ZIEBA M，WREFORD N G，et al．Resistance of the dentate gyrus to induced apoptosis during ageing is associated with increases in transforming growth factor-b1 messenger RNA[J]．Neuroscience，2001，105：853-862．

[27] POWELL R J，SIMONS M，MENDELSOHN F O，et al．Results of a double-blind，placebo-controlled study to assess the safety of intramuscular injection of hepatocyte growth factor plasmid to improve limb perfusion in patients with critical limb ischemia[J]．Circulation，2008，118(1)：58-65．

[28] KO B，HE T，GADGEEL S，et al．MET/HGF pathway activation as a paradigm of resistance to targeted therapies[J]．Ann Transl Med，2017，5(1)：4．

[29] WANG J，F(xiàn)U X，ZHANG D，et al．Effects of crenol-anib，a nonselective inhibitor of PDGFR，in a mouse model of transient middle cerebral artery occlusion[J]．Neuroscience，2017，364：202-211．