□ 陽 慧 邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院 尹樂斌 邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院 豆制品加工技術(shù)湖南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究基地 羅健濤何宏亮 楊鳳鳳 邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院

目前，食品安全問題越來越突出，食品安全問題一方面會對人的身體健康造成危害，另一方面也會對國家的經(jīng)濟(jì)和企業(yè)的發(fā)展造成一定的影響。自然發(fā)酵工藝的弊端有：①豆腐的凝乳效果極易受生產(chǎn)車間環(huán)境及生產(chǎn)的氣候的影響；②食用安全性差，會有致病菌或者腐敗菌混入；③發(fā)酵條件不穩(wěn)定，不利于豆制品行業(yè)的工廠化、規(guī)?；皹?biāo)準(zhǔn)化；④不易操作、對人員、設(shè)備的要求高等特點(diǎn)，不僅影響了豆腐得率和豆腐的品質(zhì)，更是阻礙了此類休閑豆干的進(jìn)一步推廣。這種快速發(fā)展的良好勢頭下，主要在于市場上對豆制品消費(fèi)的認(rèn)可，其中國家的調(diào)控也產(chǎn)生了很大的積極影響，這樣能夠更好地促進(jìn)豆制品加工企業(yè)的發(fā)展，使之更加規(guī)范，同時(shí)也會給豆制品企業(yè)帶來一個(gè)更好的適應(yīng)環(huán)境，推動(dòng)我國豆制品行業(yè)進(jìn)入一個(gè)快速成長期，帶動(dòng)整個(gè)行業(yè)內(nèi)部的調(diào)整。因此，我國豆制品企業(yè)在重點(diǎn)關(guān)注行業(yè)發(fā)展方向的同時(shí)，也要注重自身管理水平的提高，做出能夠推動(dòng)并適應(yīng)市場發(fā)展的新產(chǎn)品，重點(diǎn)提高產(chǎn)品的質(zhì)量，這樣才能在新時(shí)代中把握住發(fā)展的機(jī)遇。

自漢代以來，豆腐就成為我國最主要的傳統(tǒng)大豆加工產(chǎn)品，遍布大街小巷的豆腐作坊數(shù)不勝數(shù)?？梢姸垢约岸怪破飞钍軓V大消費(fèi)者喜愛，但是豆清發(fā)酵液中的微生物情況一直不清楚，有何種微生物產(chǎn)酸以及微生物的具體代謝情況尚不明確，所以難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)品質(zhì)量難以控制。乳酸菌的分離鑒定方法有很多，本文通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法從豆清發(fā)酵液中分離得到乳酸菌，通過產(chǎn)酸量等指標(biāo)篩選出優(yōu)勢產(chǎn)酸菌，再經(jīng)過菌體菌落特征、生理生化實(shí)驗(yàn)以及16S-rDNA分子生物學(xué)鑒定[1]，進(jìn)一步確定該株產(chǎn)酸菌。為后續(xù)純種發(fā)酵提供產(chǎn)酸菌株，為點(diǎn)漿技術(shù)提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑來源

豆清發(fā)酵液（湖南省恭兵食品有限公司）；NaOH（分析純，天津市化學(xué)試劑廠）；酚酞（分析純，天津市化學(xué)試劑廠）；葡萄糖（食品級，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸（分析純，西晚化工股份有限公司）；檸檬酸（食品級，天津市博迪化工股份有限公司）；硫酸銅（分析純，天津市雙船化學(xué)試劑廠）；硫酸鉀（分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；碳酸鈉（食品級，天津市雙船化學(xué)試劑廠）。

乳酸菌選擇性培養(yǎng)基（M RS）：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，牛肉膏5 g，檸檬酸三銨2 g，吐溫80 1.08 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g醋酸鈉5 g，，蒸餾水1 000 mL ，瓊脂15 g，調(diào)節(jié)pH值6.2～6.4。

1.2 儀器來源

電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；手提式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠等）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 稀釋涂布

用已滅菌的移液槍吸取1 mL的豆清發(fā)酵液樣品，使用無菌的生理鹽水分別對其進(jìn)行1-1、10-2、10-3梯度的稀釋處理，不同稀釋度懸液分別吸取0.1 mL進(jìn)行涂布并將其接種0于MRS固體的培養(yǎng)基上[2]，等菌液滲入培養(yǎng)基后，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。

1.3.2 分離純化

挑取菌落特征不同的單菌落在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離，分離純化多次，直至劃線培養(yǎng)得到單菌落。

1.3.3 產(chǎn)酸菌的初篩

分別挑取分離純化后的菌株接種于改良MRS固體培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h后，觀察是否有溶鈣圈。如果沒有溶鈣圈，不是目標(biāo)菌株。

1.3.4 產(chǎn)酸菌的復(fù)篩

通過紙層析法檢測分離[3]得到的菌株發(fā)酵產(chǎn)物中是否產(chǎn)生乳酸（用乳酸作對照）使用甲酸二正丁醇∶水=2∶10∶1的展開劑展開，緊接著用甲基紅-溴酚藍(lán)顯色劑5（0.04%溴甲酚紫酒精溶液）進(jìn)行顯色，若層析紙上的斑點(diǎn)顯現(xiàn)黃色，則此菌株為陽性，進(jìn)一步確定Rf值，若Rf值與乳酸的值相近，可確定檢測菌株為乳酸菌。

1.3.5 優(yōu)勢產(chǎn)酸菌的確定

測定比較菌種在不同發(fā)酵時(shí)期的產(chǎn)酸量與pH，篩選出產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株，編號為LDS201。

①酸量的測定：將產(chǎn)乳酸的純種菌株接入MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃的培養(yǎng)箱中搖瓶培養(yǎng)，分別在0、4、8、16、20、24 h時(shí)取出測定搖瓶內(nèi)培養(yǎng)液的乳酸量。乳酸含量測定用總酸測定方法，用標(biāo)定后的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液（約0.10 moL/L）進(jìn)行滴定測量。②pH值的測定：采用EL20 pH計(jì)測定。

1.3.6 產(chǎn)酸菌菌落菌體形態(tài)的鑒定

觀察細(xì)菌的菌落形態(tài)、菌落顏色、形狀、透明度，并挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢，藍(lán)色或紫色為革蘭氏陽性菌，紅色則為革蘭氏陰性菌。

1.3.7 產(chǎn)酸菌菌體的生理生化鑒定

對篩出的優(yōu)勢菌株進(jìn)行生理生化特性實(shí)驗(yàn)，本文應(yīng)用Sensititre（先德）微生物鑒定儀進(jìn)行鑒定。

（1）富集培養(yǎng)：將分離純化后的菌種接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，劃線培養(yǎng)，于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。

（2）濁度調(diào)整：取標(biāo)準(zhǔn)濁度管，在濁度儀上進(jìn)行調(diào)整，顯示燈亮綠色就表示可以了，再用滅菌棉簽挑取培養(yǎng)24 h的細(xì)菌菌落，在無菌狀態(tài)下接到濁度管中，振蕩搖勻，再將濁度管放在濁度儀上測量，直到調(diào)至顯示燈亮綠色。

（3）接種鑒定板：將濃度調(diào)好之后的菌懸液在無菌操作臺下倒入V型加樣槽中，然后用50μL的移液槍吸取已調(diào)好的菌懸液滴加到標(biāo)準(zhǔn)的鑒定板上，再于制定的孔中滴加石蠟油，然后貼好膜后置于恒溫培養(yǎng)箱中于35 ℃條件下培養(yǎng)。

（4）讀取數(shù)據(jù)：開啟鑒定系統(tǒng)，將已培養(yǎng)16～24 h的微生物鑒定板放到Sensititre微生物自動(dòng)鑒定儀的讀數(shù)儀上，點(diǎn)擊讀板操作，之后儀器根據(jù)反應(yīng)情況，按照概率值得出該菌株的名稱。

參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[4]第8版、《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》。

1.3.8 LDS201菌株16s rDNA序列鑒定

送上海美吉生物有限公司測序[5]，技術(shù)路線：基因組DNA提取→預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索PCR擴(kuò)增條件→特定引物PCR擴(kuò)增并純化→產(chǎn)物測序→進(jìn)化樹分析。

1.3.8.1 提取DNA

收集100 mg菌體，加液氮研磨充分；加入400 μL DNA 提取緩沖液，充分混勻；65 ℃水浴，10 min。再加入130μL 3 mol/L 醋酸鉀（KAC），冰浴5 min；加入400 μL 氯仿：異戊醇（24∶1），充分混勻；13 000 g離心10 min；移取400 μL上清入新的1.5 mL 離心管，并加入等體積的異丙醇，室溫放置10 min；棄去上清，加 入1 mL 75%乙 醇，13 000 g，2 min；棄凈上清，加入 20～30 μL ddH2O，溶解沉淀。

1.3.8.2 PCR擴(kuò)增rDNA序列

EX Taq 酶（TaKaRa），dNTP（TaKaRa），引物（Invitrogen 合成）。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性 30 s，55 ℃退火2 min，72 ℃延伸1 min 30 s，共24個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。

1.3.8.3 測序

將擴(kuò)增片段進(jìn)行測序。

1.3.8.4 BLAST

根據(jù)測序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站[6]已有序列進(jìn)行BLAST，進(jìn)而確定其分類地位。

1.3.8.5 BLAST結(jié)果的確認(rèn)

根據(jù)BLAST結(jié)果，搜索該菌種相關(guān)報(bào)道，確認(rèn)其形態(tài)特征是否吻合。如果尚且不能確定，添加相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)來證明。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酸菌的初篩

由于改良的選擇性乳酸培養(yǎng)基中添加了CaCO3，所以隨著乳酸菌的生長，乳酸菌產(chǎn)生的酸會溶解培養(yǎng)基中的CaCO3，在菌落周圍形成透明圈。有透明圈說明A、B、C菌株都產(chǎn)酸。

圖1 各菌株的溶鈣圈平板圖

表1 菌株發(fā)酵液Rf值比較

2.2 產(chǎn)酸菌的復(fù)篩

通過對所分離得到的菌株進(jìn)行紙層析法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如表1所示菌株發(fā)酵液與標(biāo)準(zhǔn)乳酸紙層析具有相近Rf值，表明菌株發(fā)酵產(chǎn)物中有乳酸。菌株C的Rf值為8.102與乳酸的最接近。

2.3 確定優(yōu)勢產(chǎn)酸菌[7]

由于乳酸菌在豆清液中的生長速度不同，所產(chǎn)生的總酸量的多少及發(fā)酵液pH值下降速度有所不同，如圖2、圖3所示。

從圖2、圖3可知，在相同的條件下，菌株C比菌株A和菌株B產(chǎn)酸多，發(fā)酵24 h內(nèi)，菌株C 產(chǎn)酸量直線上升，產(chǎn)酸性能比較穩(wěn)定，說明可以用于后續(xù)純種生產(chǎn)發(fā)酵。菌株C命名為LDS201。

2.4 菌株LDS201菌落特征和菌體形態(tài)的鑒定結(jié)果

觀察LDS201平板發(fā)現(xiàn)：菌落呈乳白色，呈圓形，中心有白點(diǎn)凸起，邊緣整齊光滑，不透明（如圖4所示），直徑約為0.7 μm，容易用針挑起，菌落質(zhì)地均勻。從平板上挑取菌株進(jìn)行革蘭氏染色，發(fā)現(xiàn)該菌體為短桿狀，革蘭氏陽性菌，如圖5所示。

2.5 菌株LDS201生理生化鑒定結(jié)果

用先德微生物儀鑒定菌株LDS201無結(jié)果，可能是微生物鑒定儀中沒有收錄這個(gè)菌株。所以設(shè)置生理生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明葡萄糖產(chǎn)酸試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、牛奶石蕊試驗(yàn)以及淀粉水解試驗(yàn)呈陽性，過氧化氫酶、V.P.試驗(yàn)、M.R.試驗(yàn)、蔗糖產(chǎn)酸試驗(yàn)、乳糖產(chǎn)酸試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)呈陰性。根據(jù)上述結(jié)果結(jié)合菌株菌落特征以及菌體形態(tài)并參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊（第8版）推斷，得出LDS201菌株為乳桿菌屬，并且此菌能利用葡萄糖產(chǎn)酸，不能利用蔗糖和乳糖產(chǎn)酸，能水解淀粉，這為后續(xù)的培養(yǎng)基優(yōu)化條件提供參考。

圖2 24 h內(nèi)發(fā)酵液總酸量的變化

圖3 24 h內(nèi)發(fā)酵液pH值的變化

圖4 LDS201菌落形態(tài)

圖5 LDS201菌體形態(tài)

圖6 菌株LDS201的16S-rDNA PCR產(chǎn)物電泳

表2 rDNA序列有意義的對比序列

2.6 LDS201菌株16s rDNA鑒定

將測序得到的16S rDNA序列在NCBI上進(jìn)行Blast比對，即可獲知與該序列同源性較高的已知序列，為確定菌種的分類學(xué)地位提供依據(jù)。微生物因?yàn)轶w積小、質(zhì)量輕、適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)，廣泛分布于自然界中。DNA測序進(jìn)行菌種鑒定比傳統(tǒng)生化鑒定更加精確。DNA測序不依賴菌種本身特點(diǎn)，對所有菌種均可適用。比傳統(tǒng)生化鑒定更加快速，準(zhǔn)確。關(guān)鍵是得到純菌株，獲得足夠的基因片段。

2.6.1 16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳

菌株LDS201的16SRNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測顯示基因組DNA條帶的位置正確，清晰可辨。結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知， Marker自左到右分 別 為 2 000、1 000、750、500、250、100。產(chǎn)物中最亮的條帶與1 500 bp位置相近，亮度和純度都達(dá)到了要求，可以繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。DNA總長度大概在1 314 bp左右，把菌株LDS201的16S rDNA測序結(jié)果提交到基因庫中，利用NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫的BLAST程序進(jìn)行序列同源性比對，按照總分從高到低，期望值由小到大，選擇前3株列于表3中。

2.6.2 構(gòu)建菌株LDS201系統(tǒng)發(fā)育樹

本文構(gòu)建了菌株LDS201系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖7所示。

圖7 LDS201菌株16S-rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

結(jié)果顯示菌株LDS201的16S-rDNA序列與解淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylolyticus）同源性達(dá)99%。再結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特征，鑒定該菌為乳桿菌屬中的解淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylolyticus）[8]。

3 結(jié)論

（1）通過乳酸菌選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)得到單菌株，有溶鈣圈說明菌株產(chǎn)酸，乳酸定性分析可以初步確定為乳酸菌。

（2）通過比較不同菌株在相同發(fā)酵時(shí)間下的產(chǎn)酸量與發(fā)酵液pH值，篩選出產(chǎn)酸量能力強(qiáng)的菌株C，編號為LDS201。

（3）通過觀察LDS201的菌落形態(tài)特征：菌落呈乳白色，呈圓形，中心有白點(diǎn)凸起，邊緣整齊平滑，不透明無光澤（如圖4所示），直徑約為0.7 μm，容易用針挑起，菌落質(zhì)地均勻，從平板上挑取菌株進(jìn)行革蘭氏染色，發(fā)現(xiàn)該菌體為短桿狀，革蘭氏陽性菌。通過生理生化指標(biāo)的測定可以初步確定為乳桿菌。經(jīng)16S-rDNA序列分析以及同源性比對，進(jìn)一步確定優(yōu)勢菌為解淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylolyticus LDS201）。