□ 趙 燕 浙江鼎龍科技有限公司 錢輝俊 杭州海泰檢測有限公司檢測中心 陳 偉 浙江鼎龍科技有限公司

1 材料與辦法

1.1 材料準(zhǔn)備

本次實(shí)驗(yàn)中使用的設(shè)備包含高效液相色譜檢測儀器、波長紫外檢測儀器、高速勻漿機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等；使用的溶劑包含甲醇標(biāo)準(zhǔn)品、冰乙酸標(biāo)準(zhǔn)品、乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品、石油醚標(biāo)準(zhǔn)品、鹽酸溶液標(biāo)準(zhǔn)品和赤霉素標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 檢測辦法

1.2.1 對標(biāo)準(zhǔn)儲備液進(jìn)行配制

稱取含量大于99.0%的赤霉素0.123 1 g，使用甲醇將其溶解同時(shí)定容到100 mL。這時(shí)該溶液的濃度為每毫升中含有1.00 mg赤霉素。

1.2.2 選取樣品處理辦法

①對溶劑進(jìn)行提取。提取劑選用了甲醇與丙酮溶液，將2.0 mg/kg赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液加入其中檢測回收率。②選擇提取方式。實(shí)驗(yàn)的樣品選定為油麥菜，同時(shí)采用高速勻漿提取方式提取2 min，使用超聲波振蕩方式處理15 min，使用超聲波振蕩方式振蕩30 min，之后對效率進(jìn)行對比。③凈化條件的選擇。選擇的實(shí)驗(yàn)樣品為西紅柿與油麥菜，將5.0 mg/kg的赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液加入樣品中，之后采用凈化處理，然后比較回收率。

1.2.3 驗(yàn)證檢測辦法線性關(guān)系、檢出限、精密度等

稀釋赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，之后使用儀器對其進(jìn)行檢測，設(shè)置y表示峰面積，x表示質(zhì)量的濃度，之后繪制回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線。在操作人員一致、實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)一致、處理方法一致的前提下，在短時(shí)間內(nèi)測量其中的赤霉素含量。之后選取三個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)，同時(shí)加入5.0 mg/kg赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，反復(fù)測試白菜樣品。然后將不同濃度的赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到番茄、白菜、辣椒、香蕉、葡萄、油麥菜中，之后測試其回收率，再對空白樣品與加標(biāo)樣品回收率進(jìn)行比較，同時(shí)重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

圖1 赤霉素溶液的高效液相色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 確定提取條件

2.1.1 溶劑的提取

將甲醇作為主要提取劑可以獲得85.3%～92.1%的回收率，將丙酮作為提取劑時(shí)可以獲得82.7%～107.3%的回收率。兩種提取劑的回收率較為類似，但相比于丙酮來說，甲醇價(jià)格低廉，同時(shí)還不會含有較高的毒性，因此在本次實(shí)驗(yàn)中赤霉素的提取溶劑采用了甲醇。

2.1.2 提取方式

使用高速勻漿與超聲波振蕩的提取方式，振蕩處理30 min后回收率分別會達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，符合實(shí)驗(yàn)要求。但使用超聲波振蕩處理方式會需要更多的時(shí)間，同時(shí)對提取瓶密封性提出較高要求，從而降低實(shí)驗(yàn)效率，因此本次實(shí)驗(yàn)中采用了高速勻漿的提取方式。

2.2 選擇凈化條件

融合C18柱固相萃取凈化方法與液液萃取方法，可以使回收率達(dá)到71.6%～89.5%，但使用液液萃取與反萃取互相結(jié)合的方式可以獲得84.5%～96.1%的回收率。可以看出，將液液萃取與反萃取凈化方式結(jié)合使用的方式，可以使凈化效果更佳，同時(shí)也不會對目標(biāo)峰附近產(chǎn)生較多干擾，因此本次實(shí)驗(yàn)選取了液液萃取與反萃取凈化互相結(jié)合的凈化方法。為了盡可能降低實(shí)驗(yàn)干擾，實(shí)施凈化處理之前，實(shí)驗(yàn)人員采用石油醚徹底清除實(shí)驗(yàn)樣品中的色素。

2.3 選取色譜條件

2.3.1 對波長進(jìn)行檢測

在200～400 nm波長范圍前提下，赤霉素的紫外吸收性最高，這時(shí)利用紫外線掃描赤霉素，可以獲取赤霉素的波長值，同時(shí)206 nm情況下會具備最強(qiáng)的吸收性，因此本文實(shí)驗(yàn)采用的波長值為206 nm，同時(shí)使用該波長對赤霉素進(jìn)行檢測。

2.3.2 色譜柱分析

赤霉素作為二萜類酸的一種，其分子特點(diǎn)為中等極性，因此對固定相進(jìn)行選擇適應(yīng)，選擇較小極性的鍵合固定相，因此在本文實(shí)驗(yàn)的色譜分析方式為C18柱[1]。

2.3.3 流動相分析

由于赤霉素自身性質(zhì)因素的影響，因此檢測過程應(yīng)在溫度較低的酸性條件下。在pH值達(dá)到3～4，赤霉素溶液處于最穩(wěn)定狀態(tài)。因此，在本次實(shí)驗(yàn)中，將0.1濃度冰乙酸水溶液與甲醇共同作為流動相。通過實(shí)驗(yàn)與結(jié)果可以看出，使用45%濃度時(shí)會獲得最佳的峰型，出峰時(shí)間更加合理，還可以加強(qiáng)雜質(zhì)的分離效果。因此實(shí)驗(yàn)中流動相使用了0.1%濃度的冰乙酸水溶液與甲醇，流動相的配比情況為45+55。

2.4 液相色譜分析

通過制作赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液與油麥菜加標(biāo)樣品的液相色譜圖，使用上文中描述的方式分析樣品，可以確保蔬菜樣品雜質(zhì)峰、目標(biāo)峰保持分離，從而充分滿足赤霉素的定量、定性需求。

2.5 對線性關(guān)系、檢出限準(zhǔn)確性進(jìn)行檢測

赤霉素的線性關(guān)系公式為：y=4E-05x+0.2785，相關(guān)系數(shù)為：r2=0.9999，從公式中可以看出線性關(guān)系較好。由于赤霉素的最低檢出濃度為0.067 mg/kg，通過對油麥菜中赤霉素含量平行性測定結(jié)果可以看出，本文采用的方法與標(biāo)準(zhǔn)偏差值不超過10%。本文使用的方法RSD值都不超過10%，可以確保重復(fù)性滿足實(shí)際應(yīng)用需求。本文采用的蔬菜水果樣品包含油麥菜、番茄、白菜、辣椒、香蕉、葡萄，通過對樣品加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行實(shí)驗(yàn)與計(jì)算后可以看出，回收率都處于71.6%～105.2%，RSD值均為2.1%～9.8%，變異系數(shù)均不超過10%，可以說明在進(jìn)行檢測與分析時(shí)，并沒有出現(xiàn)顯著的誤差，也可以證明赤霉素樣品分析結(jié)果十分準(zhǔn)確[2]。

2.6 測定方法的成立

2.6.1 樣品的預(yù)處理

在250 mL三角瓶中加入20 g試樣，之后將60 mL 80%的甲醇溶液加入其中，勻漿提取時(shí)間為2 min，之后使用布氏漏斗進(jìn)行抽濾，將提取出的溶液加入到250 mL分液漏斗中，之后使用20 mL甲醇溶液對其進(jìn)行2次重復(fù)潤洗濾渣，并將提取液合并。之后將20 mL石油醚加入到提取液中，使用混勻與靜止處理方法對其進(jìn)行處理后，可以使石油醚層被有效去除。然后將完成脫色的提取液放置在40 ℃條件下進(jìn)行減壓濃縮處理，直至容量為20 mL，在其中加入鹽酸溶液對pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，pH值達(dá)到2.5～2.8后，將20 mL乙酸乙酯加入其中并進(jìn)行3次的反復(fù)萃取，使乙酸乙酯相合并，再次進(jìn)行減壓濃縮至20 mL。再使用相同容量的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行3次反萃取，之后對磷酸鹽緩沖液進(jìn)行合并，將pH值使用鹽酸溶液調(diào)節(jié)至2.5～2.8，并加入20 mL乙酸乙酯進(jìn)行3次萃取，最后在40 ℃條件下完成減壓蒸干處理。處理后加入2 mL甲醇使殘?jiān)芙?，使?.22 μm有機(jī)濾膜進(jìn)行過濾，然后裝入瓶中為液相色譜分析做準(zhǔn)備。

2.6.2 色譜條件分析

完成液相色譜分析后，獲得以下結(jié)果：色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C184.6 mm（I.D.）×250 mm，5 μm。流動相為：甲醇結(jié)合0.1%濃度冰乙酸水溶液（45+55）；流速為1.00 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；檢測波長為206 nm。

3 結(jié)語

本文中的實(shí)驗(yàn)采用了HPLC法對蔬菜水果中赤霉素含量進(jìn)行檢測，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，實(shí)驗(yàn)方法具備較強(qiáng)的檢測準(zhǔn)確性、靈敏性，同時(shí)操作較為簡便，并不會對儀器設(shè)備提出過高要求。因此檢測人員可使用此種方法對蔬菜水果中赤霉素殘留量進(jìn)行檢測。