□ 王雅麗 張曉蕊 范翠翠 徐長隆 漢臣氏（沈陽）兒童制品有限公司

乳酸菌是一類能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的總稱，其大量存在于胃腸道中，是人體腸道內(nèi)的益生菌群，其可以代謝產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素、過氧化氫和雙乙酰等多種天然抑菌物質(zhì)，對(duì)人體健康有很大的促進(jìn)作用。大部分乳酸菌產(chǎn)品中的乳酸菌數(shù)量基數(shù)非常高，可達(dá)到1010CFU/g。乳酸菌產(chǎn)品由于其特異性、多樣性，敏感性導(dǎo)致其易受環(huán)境影響，因此檢測(cè)過程中的細(xì)微差別都可能影響活菌計(jì)數(shù)的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)從培養(yǎng)基配方的篩選、培養(yǎng)時(shí)間及培養(yǎng)方式三個(gè)方面設(shè)計(jì)，優(yōu)化出一種節(jié)約成本、縮短試驗(yàn)周期的檢驗(yàn)方法，可廣泛用于實(shí)驗(yàn)室研發(fā)及車間生產(chǎn)；同時(shí)，加強(qiáng)乳酸菌相關(guān)產(chǎn)品的檢測(cè)，對(duì)于提高產(chǎn)品質(zhì)量，保護(hù)消費(fèi)者的利益及健康，都有重要的意義[1-2]。

1 材料和設(shè)備

1.1 菌種

植物乳桿菌HCS03-007：漢臣氏（沈陽）兒童制品有限公司分離，實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 合成MRS

合成MRS購于北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 自配MRS

蛋白胨1 0 g，牛肉粉5g，酵母粉4g，磷酸氫二鉀2g，檸檬酸三胺2g，醋酸鈉5g，葡萄糖20g，吐溫-80 1mL，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，調(diào)節(jié)pH值6.2，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，121℃高壓滅菌20 min。

1.2.3 番茄汁MRS

在自配MRS中添加1%的番茄汁（番茄汁制備方法：新鮮的番茄洗凈，稱取100g于榨汁機(jī)內(nèi)粉碎充分，煮沸5min，三層紗布過濾后，用水補(bǔ)至200mL）。

1.2.4 pH6.0/6.4MRS

自配MRS調(diào)節(jié)pH值6.0/6.4。

1.3 實(shí)驗(yàn)器皿

300mL錐形瓶、移液槍、10mL離心管、玻璃平皿等。

1.4 儀器與設(shè)備

電子天平、pH計(jì)、蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、厭氧培養(yǎng)袋、產(chǎn)氣包等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)通過單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)時(shí)間、需氧型等方面對(duì)HCS03-007植物乳桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，挑選合適條件對(duì)以后實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 操作步驟

2.2.1 菌種活化

將公司實(shí)驗(yàn)室-80℃保存的凍存管HCS03-007進(jìn)行活化，以10%的接種量接種，傳代三次，得到的菌種冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 系列稀釋及計(jì)數(shù)培養(yǎng)

將上述活化后的第三代菌液用0.85%的無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，根據(jù)對(duì)樣品濃度的估計(jì)，選擇10-6、10-7的樣液加入相應(yīng)的培養(yǎng)基，進(jìn)行需氧和厭氧培養(yǎng)，48h計(jì)數(shù)一次，記錄結(jié)果，繼續(xù)培養(yǎng)至72h，計(jì)數(shù)并記錄結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)詳見表1。

根據(jù)表1可知，HCS03-007植物乳桿菌培養(yǎng)48h與72 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全沒有變化，故確定計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)采取48h培養(yǎng)；HCS03-007植物乳桿菌在需氧、厭氧條件下計(jì)數(shù)結(jié)果差異不顯著，說明植物乳桿菌在培養(yǎng)過程中，對(duì)氧氣的敏感度低，故確定計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)采取需氧培養(yǎng)；HCS03-007植物乳桿菌在合成培養(yǎng)基中計(jì)數(shù)結(jié)果最佳，其次為番茄汁MRS，且合成培養(yǎng)基中的結(jié)果僅為番茄汁MRS的1.05倍，差異不顯著，考慮到成本因素，故確定計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基為番茄汁MRS。

表1 植物乳桿菌HCS03-007菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)確定了適用于植物乳桿菌計(jì)數(shù)的培養(yǎng)基為添加1%番茄汁、pH值為6.2的自配MRS培養(yǎng)基，需氧培養(yǎng)48 h進(jìn)行計(jì)數(shù)。本實(shí)驗(yàn)初步對(duì)植物乳桿菌計(jì)數(shù)方法進(jìn)行了優(yōu)化，后續(xù)還可開展試驗(yàn)操作角度的優(yōu)化，如培養(yǎng)基灌注方式，點(diǎn)樣或涂布計(jì)數(shù)等，以期在處理大量樣品時(shí)，找到一種有效、簡單、快速和相對(duì)經(jīng)濟(jì)的活菌計(jì)數(shù)方法。