□ 張麗琴 安艷蘇 肖植國 曲靖市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心

食品安全問題是關(guān)系到千千萬萬人民群眾切身利益的社會問題，受到人們的廣泛關(guān)注，其中，致病菌的污染是導(dǎo)致食品安全問題的重要原因之一，在食物中毒案例中，由致病菌所致的細(xì)菌性食物中毒爆發(fā)起數(shù)和發(fā)病人數(shù)多年來位居我國首位[1]。常見的食源性致病菌主要是沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157:H 7、單核細(xì)胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌等?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》（GB29921-2013）[2]對各類食品中的致病菌限量進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定。現(xiàn)階段食品檢驗(yàn)逐漸成為保證食品安全的關(guān)鍵手段，是食品流向市場交易前的必經(jīng)重要環(huán)節(jié)[3]，而致病菌的檢驗(yàn)是一項(xiàng)系統(tǒng)而又復(fù)雜的工作。傳統(tǒng)的檢測方法，主要包括形態(tài)檢查和生化方法，完全依靠人工操作，需要投入大量的人力、物力，且耗時(shí)長[4]，難以滿足目前檢驗(yàn)任務(wù)重、批量大的形勢。本文對BAXRSystemQ7全自動病原微生物快速檢測法與傳統(tǒng)檢測方法進(jìn)行對比討論，對BAXRSystemQ7全自動病原微生物快速檢測方法在食品致病菌檢測中的優(yōu)勢進(jìn)行了探討，以期為提高食品中致病菌的檢測效率提供參考。

BAXRSystemQ7全自動病原微生物快速檢測系統(tǒng)建立在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對各類致病菌進(jìn)行快速檢測，其原理是：使用熒光染料標(biāo)記特異性探針，DNA雙鏈通過一系列連續(xù)的變性、退火和延伸的過程，使待檢病原菌的特異性DNA片段以指數(shù)方式擴(kuò)增，在此期間，熒光信號實(shí)時(shí)自動地被檢測和分析，從而使結(jié)果以“有或無”的形式在1個(gè)小時(shí)內(nèi)顯示。BAXRSystemQ7全自動病原微生物快速檢測系統(tǒng)的各類檢測試劑盒都采用了杜邦專利的PCR試劑藥片化技術(shù)，所有PCR試劑都被整合在一片藥片中，包含高度特異性的探針以及其他PCR反應(yīng)所需試劑，例如：DNA聚合酶、引物、dNTP、緩沖液等，大大簡化了操作步驟，減少了人為誤差。相比傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)分離鑒定方法，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有更快的速度，更高的特異性和靈敏度。

1 檢測方法分析

1.1 待測樣品的制備

以無菌操作取樣25 g（mL），加入225 mL相應(yīng)滅菌稀釋液，根據(jù)不同致病菌要求進(jìn)行增菌培養(yǎng)或直接檢測，如沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157:H7、金黃色葡萄球菌（第一法）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（第一法）、副溶血性弧菌定性等，一般需增菌培養(yǎng)18～24 h。同時(shí)，接種相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)菌株于225 mL已滅菌的稀釋液中，與上述樣品統(tǒng)一條件下培養(yǎng)，作為陽性對照。

1.2 致病菌的檢測

1.2.1 傳統(tǒng)方法檢測（國家標(biāo)準(zhǔn)法）

（1）分離培養(yǎng)。按照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，對以上樣品溶液及對照溶液進(jìn)行下一步的稀釋、分離，最終接種到相應(yīng)的選擇性平板中進(jìn)行培養(yǎng)，這幾個(gè)環(huán)節(jié)至少需要18～24 h（大腸埃希氏菌O157:H7、金黃色葡萄球菌（第一法）、副溶血性弧菌），沙門氏菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌需要48 h才能完成。

（2）觀察菌落形態(tài)。觀察上述選擇性平板中菌落形態(tài)，確定可疑菌落。

（3）生化鑒定。根據(jù)致病菌標(biāo)準(zhǔn)要求對可疑菌落進(jìn)行進(jìn)一步的分離或通過氧化酶實(shí)驗(yàn)、革蘭氏染色、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)、三糖鐵瓊脂實(shí)驗(yàn)、嗜鹽性實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行最終鑒定。

1.2.2 BAXRSystemQ7方法檢測

根據(jù)所需要進(jìn)行的反應(yīng)個(gè)數(shù)取適量的裂解液,按每1 mL裂解液中加入12.5 μL蛋白酶比例添加蛋白酶試劑，充分混勻后吸取200 μL上述混勻后的裂解液加入各裂解管；取上述1.1中的樣品溶液及對照溶液各5 μL，分別加至對應(yīng)裂解管，將上述裂解管放置于設(shè)置好的裂解儀加熱模塊上，進(jìn)行裂解，將裂解后的裂解管插入冷卻模塊，冷卻5 min。量取30 μL處理好的樣品液及對照溶液至試劑盒配套的PCR管中（含有PCR反應(yīng)需要的所有試劑），上機(jī)檢測。整個(gè)過程只需3.5～5 h。

2 結(jié)果

傳統(tǒng)檢測方法通過一系列的分離鑒定，可確定結(jié)果是否為致病菌陽性，同時(shí)可對致病菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，得出含量；BAXRSystemQ7檢測方法可通過上機(jī)后直接得出致病菌陽性或陰性，但不能得出致病菌的含量。

3 討論

（1）傳統(tǒng)檢測方法是通過長期大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的，其準(zhǔn)確性、靈敏性均較高，是在食品致病菌檢測工作中主要采用的方法，但該方法步驟多，操作繁瑣，完全依靠人工操作，一般需要數(shù)天才能完成[5]。且致病菌種類繁多，完全根據(jù)細(xì)菌形態(tài)、生化或血清分型，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且結(jié)果受試劑質(zhì)量差異、實(shí)驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)豐富程度等因素影響較大，實(shí)驗(yàn)過程容易相互污染，導(dǎo)致錯誤。

（2）BAXRSystemQ7 方法優(yōu)點(diǎn)在于特異性強(qiáng)，假陽性低，耗時(shí)短， 靈敏度是傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法的100～1 000倍，無需免疫富集即可檢出。這樣的靈敏度可以保證絕大多數(shù)病原體不到24 h得到結(jié)果。該方法已被美國農(nóng)業(yè)部食品安全檢測機(jī)構(gòu)采納作為標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，也得到AOAC 認(rèn)證，作為突發(fā)食源性致病菌污染事件應(yīng)急反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法[6]。但該方法目前只能對致病菌進(jìn)行快速定性，在定量方面有待進(jìn)一步研究，且無法培養(yǎng)、不能夠生化檢定且不能夠觀察微生物產(chǎn)物[7]。

4 結(jié)論

BAXRSystemQ7全自動病原微生物快速檢測系統(tǒng)自動化程度高，操作簡易，檢驗(yàn)快捷，精準(zhǔn)性高[8]，可作為食源性致病菌爆發(fā)時(shí)的緊急檢測方法，也可在日常檢測工作中用于致病菌的快速定性檢測。對于需要定量檢測的致病菌，如金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌等，可優(yōu)先選用BAXRSystemQ7全自動病原微生物快速檢測系統(tǒng)進(jìn)行初篩，再根據(jù)篩選結(jié)果結(jié)合傳統(tǒng)檢測方法進(jìn)行定量分析，這樣可大大提高檢測的效率。檢驗(yàn)檢測技術(shù)人員在選擇這一檢測技術(shù)方法時(shí)要根據(jù)實(shí)際情況科學(xué)決策，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。