李濤 賴春鳳 鄭敏莉 楊宇輝 丘波
嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院 1病理學(xué)教研室,2內(nèi)科教研室,3生理學(xué)教研室(廣東梅州 514031)
食管癌是世界上第六大導(dǎo)致癌癥死亡的原因,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,其病因與組織學(xué)類型及所發(fā)現(xiàn)的人群都有所不同[1]。在美國(guó),每年都有16 940例新發(fā)病例和15 690例死亡病例[2]。而中國(guó),2015年食管癌發(fā)病人數(shù)估計(jì)為477 900例,占全部惡性腫瘤發(fā)病的11.1%;估計(jì)死亡人數(shù)為375 000例,占全部惡性腫瘤病死率的13.3%[3]。同時(shí),在世界范圍內(nèi),食管癌具有明顯的地域分布特點(diǎn),存在從土耳其東部開始,經(jīng)伊拉克、伊朗、中亞,一直延伸到中國(guó)北部的一個(gè)食管癌高發(fā)地帶。食管癌的發(fā)生與不同的遺傳和環(huán)境因素有著密切的關(guān)系,其中基因的多態(tài)性研究與食管癌的關(guān)系研究為關(guān)注的熱點(diǎn),但結(jié)論不一??图胰巳菏蔷哂歇?dú)特遺傳背景的漢族分支,有著相對(duì)特殊的遺傳背景和飲食習(xí)慣,而梅州地區(qū)是主要的客家人群的聚居地,居民大部分為純正的客家人。有資料顯示,食管癌在1997-2011年均列住院患者惡性腫瘤的第1位[4],是影響該地區(qū)居民的健康水平主要疾病之一。目前,對(duì)客家人群食管癌的研究較少,而該人群食管癌與基因多態(tài)性的研究國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。因此,本研究通擬過選取DNA損傷修復(fù)基因XRCC1 rs25487、細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)基因P53 rs1042522、COX-2 rs689466位點(diǎn),檢測(cè)其基因型和等位基因在客家人群中的分布特征,探討基因多態(tài)性與該人群人群食管癌遺傳易感性的關(guān)系,為客家人群食管癌的防治提供理論依據(jù)。
1.1 研究對(duì)象 嚴(yán)格遵循隨機(jī)、均衡及盲法原則,病例診斷嚴(yán)格按照ICD-151標(biāo)準(zhǔn)分類,選取了2013年9月至2015年1月在嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及廣東省梅州市人民醫(yī)院經(jīng)胃鏡和病理檢查確診的新發(fā)住院的食管癌患者122例,并隨機(jī)抽取同期健康體檢人群,同為客家人群、同居住年限的非消化道疾病、非腫瘤患者123例作為對(duì)照,均做到了知情同意。所有研究對(duì)象于住院次日或體檢日清晨抽取外周血3 mL,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,-80℃冰箱低溫保存。
1.2 方法
1.2.1 外周血DNA的提取 提取經(jīng)EDTA-Na2抗凝管采集的靜脈血,用DNA提取試劑盒(Wizard Genomic DNA purification Kit(Promega))提取DNA,通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度、純度和降解程度,通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD值,調(diào)整DNA終濃度在10~30 ng/μL之間,提取后的DNA保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 位點(diǎn)選擇和引物設(shè)計(jì) 選取XRCC1基因rs25487、P53基因rs1042522、COX-2基因rs689466位點(diǎn),根據(jù)基因的目標(biāo)序列和所選擇的多態(tài)性位點(diǎn),運(yùn)用Sequenom公司的Assay Design 3.1軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。將合成的引物通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF)進(jìn)行質(zhì)檢,檢測(cè)實(shí)際分子量與理論分子量一致,引物純度均達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。引物設(shè)計(jì)結(jié)果見表1。
表1 基因位點(diǎn)及引物序列Tab.1 Gene locus and primer sequences
1.2.3 基因分析 提取純化后的基因組DNA樣品定量稀釋,按設(shè)計(jì)順序加樣于384孔板上,然后添加PCR擴(kuò)增體系使反應(yīng)物的終濃度如下:1 U的Taq聚合酶,20~ 50 ng基因組DNA,各2.5 pmol的PCR引物,2.5 mmol的dNTP。PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃ 2 min,95 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,45個(gè)循環(huán),72℃5 min,25℃∞。添加0.3 U的堿性磷酸酶去除剩余的dNTP。單堿基延伸反應(yīng)通過配制總體積為2 μL的單堿基延伸反應(yīng)Mix,反應(yīng)條件為94℃5 s,然后52℃5 s,40個(gè)外部循環(huán),80℃5 s×5個(gè)內(nèi)部循環(huán),72℃ 3 min,25℃∞。反應(yīng)產(chǎn)物用樹脂純化,然后將純化后的延伸產(chǎn)物點(diǎn)樣于384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上。再經(jīng)MALDI-TOF-MS(基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜)分析,最后運(yùn)用Typer 4.0軟件檢測(cè)質(zhì)譜峰,并根據(jù)質(zhì)譜峰圖判讀各樣本目標(biāo)位點(diǎn)基因型。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 分別統(tǒng)計(jì)食管組和對(duì)照組基因型分布頻率,經(jīng)Hardy-Wein-berg平衡檢驗(yàn)后,使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,各基因型及等位基因分布頻率差異用二元Logistic回歸分析以及χ2檢驗(yàn),以O(shè)R與95%CI表示相對(duì)危險(xiǎn)度,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 兩組年齡、性別比較 食管癌組(男85例,女37例)與正常對(duì)照組(男74例,女49例)之間的性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。食管癌組年齡為43~85歲,均數(shù)為(59.97±9.09)歲,正常對(duì)照組年齡為39~85歲,均數(shù)為(57.89± 10.55)歲,經(jīng)過t檢驗(yàn),兩組總體均數(shù)的差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。食管癌組年齡分布具有以下特點(diǎn):50~60歲食管癌患者比例最大,在55歲左右形成發(fā)病高峰,之后隨著年齡的下降而下降。性別上男性多于女性,比值接近2∶1(男∶女)。見表2、3。
表2 兩組之間年齡的比較Tab.2 Comparison of age between the two groups±s
表2 兩組之間年齡的比較Tab.2 Comparison of age between the two groups±s
組別食管癌組正常對(duì)照組例數(shù)122 123年齡(歲)59.97±9.09 57.89±10.55 t值1.653 P值0.100
例表3 兩組之間性別的比較Tab.3 Comparison of gender between the two groups
2.2 rs25487、rs1042522和rs689466位點(diǎn)多態(tài)性分布 對(duì)梅州地區(qū)客家人群中XRCC1基因rs25487、P53基因rs1042522、COX-2基因rs689466共3個(gè)位點(diǎn)的進(jìn)行檢測(cè),兩組間基因型分布頻率及等位基因構(gòu)成比統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4、5。
表4結(jié)果顯示,XRCC1基因rs25487、P53基因rs1042522、COX-2基因rs689466共3個(gè)位點(diǎn)均存在有多態(tài)性變化,rs25487基因型GG、GA和AA在食管癌中的分布頻率為:57.38%、37.70%和4.92%,在對(duì)照組的分布頻率為47.97%、42.28%和9.75%,組間差異無顯著性(χ2=3.301,P=0.192);rs1042522基因型CC、CG和GG在食管癌組的分布頻率為:20.49%、54.92%和24.59%,在對(duì)照組的分布頻率為17.07%、47.16%和35.77%,組間差異無顯著性(χ2=3.640,P=0.162);rs689466基因型AA、AG和GG在食管癌組的分布頻率為:22.13%、54.92%和22.95%,在對(duì)照組的分布頻率為25.20%、52.85%和21.95%,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.320,P=0.852),再經(jīng)二元Logistic回歸分析也顯示兩組間各基因型比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
表4 客家人群基因型在兩組中的分布Tab.4 Distribution of genotypes of Hakkaness in two groups例(%)
表5 客家人群等位基因在兩組中的分布Tab.5 Distribution of alleles of Hakkaness in two groups
表5的結(jié)果顯示,XRCC1基因rs25487、P53基因rs1042522、COX-2基因rs689466各等位基因在兩組間比較差異無顯著性:rs25487(χ2=3.129,P=0.077)、rs1042522(χ2=2.646,P=0.104)、rs689466(χ2=0.203,P=0.652)。
2.3 rs25487、rs1042522和rs689466位點(diǎn)基因型組間年齡、性別分層分析 通過對(duì)XRCC1、P53和COX-2基因共3個(gè)位點(diǎn)的基因型在食管癌組和正常對(duì)照組的年齡和性別進(jìn)行分層,結(jié)果顯示,性別及年齡在兩組間差異均未見有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示:XRCC1基因rs25487、P53基因rs1042522、COX-2基因rs689466位點(diǎn)基因型與不同的年齡、性別與否無關(guān)。
X線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(X-ray repair crosscomplementing 1,XRCC1),是第一個(gè)被分離的哺乳動(dòng)物基因,在DNA的損傷修復(fù)、遺傳不穩(wěn)定性和腫瘤發(fā)生起到關(guān)鍵作用。XRCC1參與了離子輻射和化學(xué)誘變劑所致DNA損傷后的單鏈斷裂修復(fù)(SSBR)和堿基切除修復(fù)(BER)。XRCC1 399Arg→Gln的變異降低了個(gè)體DNA損傷修復(fù)能力,導(dǎo)致體細(xì)胞突變及染色體畸變率增加,可能增加腫瘤的易感性。已有多項(xiàng)針對(duì)XRCC1基因多態(tài)性與惡性腫瘤相關(guān)研究[5-7],其與食管癌關(guān)系的研究也有多項(xiàng)報(bào)道,但結(jié)果不盡一致。YUN等[8]研究發(fā)現(xiàn)XRCC1基因與患食管癌的風(fēng)險(xiǎn)無相關(guān),但單體型CGC與減小ESCC的風(fēng)險(xiǎn)有顯著意義(OR:0.62,95%CI:0.40~0.96),認(rèn)為在中國(guó)人群中基因-基因相互作用在食管癌的發(fā)展中起了重要作用,LI等[9]研究也顯示在韓國(guó)和中國(guó)哈爾濱的漢族的人群中XRCC1 Arg399Gln多態(tài)性與食管癌無關(guān),與本課題研究結(jié)論一致。但是也有部分的研究報(bào)道了XRCC1基因Arg399Gln位點(diǎn)位點(diǎn)與食管癌的易感性有一定的關(guān)聯(lián)性,認(rèn)為在中國(guó)人群中XRCC1 Arg399Gln可以作為一種潛在的食管癌易感性的標(biāo)志物,尤其是鱗狀細(xì)胞癌[10]。
p53抑癌基因,定位于人類染色體17p13.1,有11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子,是腫瘤最常見突變的基因,p53基因編碼區(qū)第4外顯子第72位密碼子存在單核苷酸多態(tài)性(p53 Arg72Pro,rs1042522),是與腫瘤關(guān)系最為密切的一個(gè)多態(tài)位點(diǎn),使p53蛋白中的第72位氨基酸由脯氨酸變?yōu)榫彼?,引起p53蛋白結(jié)構(gòu)改變和功能異常。迄今為止,已有諸多關(guān)于p53 Arg72Pro與食管鱗癌關(guān)聯(lián)研究的報(bào)道,結(jié)果也不盡相同。內(nèi)蒙古[11]的人群研究結(jié)果認(rèn)為p53密碼子72Arg/Pro基因多態(tài)性與食管癌易感性相關(guān),與多項(xiàng)Meta分析[12-13]及部分國(guó)外報(bào)道是一致的[14-15],但也有相反的報(bào)道[16]。環(huán)氧化酶(COX)又稱前列腺素合成酶,是花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎氐年P(guān)鍵酶。COX-2是誘導(dǎo)型環(huán)氧化酶,在抑制凋亡、腫瘤生長(zhǎng)、血管形成等腫瘤發(fā)生過程中起著重要作用。COX-2基因啟動(dòng)子區(qū)存在有-765G>C和-1195G>A單核苷酸多態(tài)性,其通過改變COX-2基因的表達(dá)調(diào)控或基因產(chǎn)物的活性而影響腫瘤易感性。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)-1195G>A單核苷酸多態(tài)性與多種胃腸道腫瘤易感性有著密切相關(guān)性[17-19],-1195AA基因型能增加患ESCC的風(fēng)險(xiǎn),且環(huán)氧合酶2的遺傳性變型可能影響食管癌的易感性[20]。本研究選取的細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)的位點(diǎn)rs1042522和rs689466,在客家人群中也存在多態(tài)性,但研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)其與食管癌的相關(guān)性,與部分研究一致。
客家人群是具有獨(dú)特遺傳背景的漢族分支,有著相對(duì)特殊的遺傳背景和飲食習(xí)慣。客家人在全世界有約1.2億人口,國(guó)內(nèi)約有5 800多萬(wàn),客家人也是廣東省三大民系之一。羅香林認(rèn)為客家人是“中原最純正的正統(tǒng)漢人的后裔”[21]。客家人與中原漢族最近,又偏向于苗瑤語(yǔ)族群中的畬族,不同于其他南方漢族偏向于侗臺(tái)語(yǔ)族群[22],對(duì)該群某些基因多態(tài)性的研究也顯示其有別于其他漢族民系[23]。以上都提示了遺傳因素與客家人群有著重要的相關(guān)性。目前,針對(duì)客家人群基因多態(tài)性與惡性腫瘤的研究較少,本次研究選取了XRCC1、P53和COX-2基因共3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了多態(tài)性研究,結(jié)果顯示出rs25487、rs1042522和rs689466位點(diǎn)在客家人群中均有多態(tài)性變化。而經(jīng)過對(duì)基因型和等位基因的分布頻率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)和二元Logistic回歸分析未發(fā)現(xiàn)其位點(diǎn)的多態(tài)性變化與該人群的食管癌易感性存在相關(guān)性。同時(shí)也對(duì)性別和年齡進(jìn)行分層分析也未發(fā)現(xiàn)有顯著性相關(guān)。本項(xiàng)目的研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)外部分學(xué)者的研究結(jié)果是相符合的,可能也反映了以上基因位點(diǎn)多態(tài)性的變化與該地區(qū)食管癌的遺傳易感性無關(guān),同時(shí)也充分說明了基因多態(tài)性的特點(diǎn),可能在不同種族、遺傳背景下,不同地域之間基因多態(tài)性存在差異性。但是也需要考慮樣本量較少的原因,本研究的樣本量可能還不足以完全代表該地區(qū)整個(gè)食管癌人群基因多態(tài)性的變化。因此,下一步計(jì)劃要了解整個(gè)客家人群食管癌遺傳易感性與基因多態(tài)性的關(guān)系,需要對(duì)多個(gè)客家地區(qū)進(jìn)行大樣本量的調(diào)查,也需要多個(gè)醫(yī)療機(jī)構(gòu)和醫(yī)學(xué)院所的共同參與完成,研究數(shù)據(jù)將為該人群在食管癌的防控中提供理論依據(jù)。
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