張緒美 張燕 陳敏
濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科(山東濰坊261031)
膠質(zhì)細胞瘤(glioma)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤,其發(fā)病率約占所有顱內(nèi)腫瘤的45%左右,膠質(zhì)瘤的浸潤復發(fā)是導致患者死亡的主要原因。研究膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移機制,尋找有效的治療靶點是膠質(zhì)瘤治療中需要解決的問題。最近的研究發(fā)現(xiàn),多種上皮來源的腫瘤細胞能夠合成免疫球蛋白G(IgG),并影響腫瘤細胞的分化、增殖、侵襲[1-2],這逐漸成為腫瘤免疫研究的新熱點,并且近年來一項前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)IgG是前列腺癌治療的潛在靶點[3]。但是IgG在膠質(zhì)瘤中的表達、分布及其對膠質(zhì)瘤浸潤、復發(fā)的影響罕見有報道。Gabs家族蛋白[Grb2-associated binder(Gab)family proteins]是一類支架蛋白,Gabs蛋白包括Gab1~4多個家族成員,其中Gab2調(diào)控細胞生長增殖、分化、凋亡、侵襲等生命過程,具有潛在的原癌基因特性。PTEN是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因,在許多不同類型的腫瘤組織中存在著PTEN基因不同程度的突變或丟失。本研究應用原位雜交、免疫組化方法探測人腦膠質(zhì)瘤中mRNA及IgG蛋白的表達,并分析其與Gab2、PTEN蛋白表達的關系,探測其對膠質(zhì)瘤生物學行為的影響,為膠質(zhì)瘤的治療提供理論依據(jù)。
1.1 標本來源 選取濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院、濰坊市人民醫(yī)院2011年1月至2013年12月手術切除并經(jīng)病理證實的膠質(zhì)瘤標本55例。男30例,女25例,年齡11~74歲,中位年齡44歲。按WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤分類標準進行分級,并將Ⅰ~Ⅱ級歸為低級別組,Ⅲ~Ⅳ級為高級別組,低級別組25例,高級別組30例。所有標本均用100 mL/L的甲醛溶液固定,石蠟包埋切片,厚4 μm。另取20例正常腦組織(腦外傷內(nèi)減壓獲得)作為對照。
1.2 試劑 IgG多克隆抗體購自SIGMA公司。原位雜交探針及相關試劑由濰坊醫(yī)學院牛娜博士提供。Gab2多克隆抗體購自Santa Cruz公司。PTEN單克隆抗體、SP試劑盒、DAB試劑盒、AEC試劑盒均購自福州邁新生物公司,操作步驟按說明書進行。PBS液代替一抗作陰性對照。
1.3 檢測方法 免疫組化SP二步法檢測IgG、Gab2、PTEN蛋白表達,石蠟標本5 μm切片,常規(guī)脫蠟入水,熱抗原修復,SP法免疫組化染色,Gab2、PTEN兩種抗體DAB鏡下控制顯色,IgG抗體AEC鏡下控制顯色。PBS液代替一抗作免疫組化陰性對照,IgG正義探針作為原位雜交陰性對照。
1.4 結(jié)果判定 顯微鏡下隨機觀察10個高倍視野,每個視野計數(shù)100個細胞。IgG蛋白以腫瘤細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)紅色顆粒為陽性。Gab2陽性染色為棕黃色顆粒,分布于膠質(zhì)瘤細胞膜和細胞漿。PTEN陽性表達位于細胞胞質(zhì),胞核部位出現(xiàn)著色視為陰性。IgG mRNA陽性信號為藍紫色,呈細顆粒狀,分布于腫瘤細胞胞漿。
免疫組化結(jié)果判定:觀察染色強度、部位、并計算陽性細胞數(shù):靶細胞陽性率<5%為0分,5%~25%為1分,25%~50%為2分,>50%為3分;著色強度按切片中細胞顯色有無及染色深淺記分,細胞無顯色為0分,淺棕黃色(淡紅色)為1分,棕黃色(紅色)為2分,棕褐色(深紅色)為3分。將兩計分相加,0~1分蛋白表達陰性,≥2分為蛋白表達陽性。原位雜交結(jié)果判定:只要腫瘤細胞胞漿內(nèi)見到紫藍色顆粒,即為IgG mRNA陽性。
1.5 統(tǒng)計學方法 采用SAS 9.1統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,IgG、Gab2及PTEN在各級別膠質(zhì)瘤中的表達率比較采用χ2檢驗,IgG、Gab2及PTEN表達相關性分析采用Spearman等級相關分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 IgG、Gab2、PTEN在膠質(zhì)瘤中的表達 膠質(zhì)瘤組織中有IgG蛋白及IgG mRNA表達(圖1、2)。IgG在膠質(zhì)瘤組織中表達陽性率為69.0%(38/55),在正常腦組織中表達率為5.0%(1/20),差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=24.136 8,P< 0.05);膠質(zhì)瘤組織中Gab2陽性率為52.7%(29/55),在正常腦組織中表達率為5.0%(1/20),差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=13.920 5,P<0.05);PTEN在膠質(zhì)瘤中表達率為25.5%(14/55),在正常腦組織中表達陽性率為85.0%(17/20),差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=21.445 5,P< 0.05)。見圖3、4、表1。
圖1 IgG蛋白Ⅲ級在膠質(zhì)瘤中的表達,細胞漿可見紅色顆粒(×400) 圖2 高級別膠質(zhì)瘤細胞漿中IgG mRNA的陽性信號(ISH×200)glioma gradeⅢ 圖3 Gab2蛋白在Ⅲ級膠質(zhì)瘤表達,細胞漿可見棕黃色顆粒(+++)(×400) 圖4 PTEN蛋白在正常腦組織表達,細胞漿可見棕黃色顆粒(+++)(×400)Fig.1 Positive IgG protein in glioma gradeⅢ Fig.2 Positive IgG mRNA in glioma gradeⅢ Fig.3 Positive Gab protein in glioma grade Ⅲ Fig.4 Positive PTEN protein in normal brain(+++)(× 400)
IgG在低級別膠質(zhì)瘤中的表達率為44.0%(11/25),在高級別膠質(zhì)瘤中表達率為90.0%(27/30),差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=13.511 6,P< 0.05)。Gab2在低級別膠質(zhì)瘤中的表達率為36.0%(9/25),在高級別膠質(zhì)瘤中的表達率為66.7%(20/30),差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=5.145 0,P< 0.05)。PTEN在低級別膠質(zhì)瘤中的表達率為32.0%(8/25),在高級別膠質(zhì)瘤中的表達率為20.0%(6/30),差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.0348,P>0.05)。見表2。
2.2 膠質(zhì)瘤中IgG表達與Gab2、PTEN表達的相關性 膠質(zhì)瘤中IgG表達與Gab2、PTEN表達的相關性,見表3。膠質(zhì)瘤中IgG與Gab2表達呈正相關(r= 0.312 4,P<0.05),與PTEN 表達呈負相關(r=-0.422 0,P< 0.05)。
表1 正常腦組織與腦膠質(zhì)瘤中IgG、Gab2、PTEN蛋白陽性率比較Tab.1 Expressions of IgG,Gab2 and PTEN in glioma and normal brain tissue 例(%)
表2 低級別與高級別膠質(zhì)瘤中IgG、Gab2、PTEN陽性率比較Tab.2 Expressions of IgG,Gab2and PTEN in high grade glioma and low grade glioma 例(%)
表3 膠質(zhì)瘤中IgG表達與Gab2、PTEN表達的相關性分析Tab.3 The relationship of IgG protein expression with Gab2 and PTEN in glioma 例
膠質(zhì)瘤系浸潤性生長物,手術難以切除或根本不能手術,其浸潤和復發(fā)是導致患者死亡的主要原因。近年來,隨著研究的深入,免疫靶向治療成為膠質(zhì)瘤臨床研究的重點,對腫瘤免疫分子的研究也是腫瘤研究的熱點。
經(jīng)典的免疫學理論認為,免疫球蛋白是B淋巴細胞產(chǎn)生的,其他的體細胞不會表達免疫球蛋白。但近年來研究發(fā)現(xiàn)[4],該蛋白以及mRNA存在于免疫細胞之外的其他細胞中,特別是一些增生的上皮細胞和癌細胞中,如乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌等,其類似生長因子,具有促進腫瘤細胞增殖、抑制凋亡的作用。CHEN等[1]同樣證實了上皮來源的癌細胞分泌的IgG能夠促進腫瘤細胞的生長和生存。在結(jié)直腸癌組織中,IgG的表達和腫瘤的惡性程度,包括分化、Dukes分期具有顯著相關性,即結(jié)直腸癌分化程度越差,Dukes分期越高,表達IgG越多[5]。通過小干擾RNA技術抑制前列腺癌細胞中IgG表達后,癌細胞的增殖標志物降低[3]。本研究觀察到,IgG在正常腦組織中低表達,隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加,表達水平逐漸升高,這與文獻[6]報道一致,表明IgG可能促進膠質(zhì)瘤的發(fā)生、增殖。綜合上述研究筆者推測腫瘤細胞產(chǎn)生的IgG有可能成為抗膠質(zhì)瘤治療的新靶點,為腫瘤的預后判斷及治療提供新的思路。
多項研究表明,Gab2是腫瘤相關蛋白,具有潛在的原癌基因特性,它的異常活化和表達促進腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移[7-8]。MATSUMURA等[9]發(fā)現(xiàn),Gab2在結(jié)腸癌組織中高表達,Gab2表達高的患者生存期明顯低于低表達者。通過干擾技術抑制或者降低Gab2的表達后,膠質(zhì)瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力降低[10-11]。本研究觀察到,Gab2蛋白在不同病理級別的膠質(zhì)細胞瘤中的表達隨著臨床病理級別的增高有增高的趨勢,進一步說明Gab2的表達與腦膠質(zhì)瘤惡性進展有關。Gab2可以作為預測膠質(zhì)瘤預后的一個指標,有望成為膠質(zhì)瘤治療的新靶點。
有研究證實,Gab2活化后與磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的P85亞基結(jié)合,通過參與PI3K/Akt/ARK5信號通路促進乳腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移[12],而抑癌基因PTEN也是與PI3K的P85亞基結(jié)合,正調(diào)節(jié)PI3K/PTEN信號通路的活性[13],并且PI3K/PTEN信號通路與腫瘤血管的形成及腫瘤的增殖轉(zhuǎn)移相關[14-15]。本研究還檢測到膠質(zhì)瘤中IgG與Gab2高表達,二者表達呈正相關,PTEN低表達,與IgG表達呈負相關,提示三者相互作用,是否在膠質(zhì)瘤中IgG也參與了PI3K信號通路,是否通過正調(diào)節(jié)PI3K信號通路就能抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖、侵襲,這有待于下一步的研究證實。
綜上所述,IgG在膠質(zhì)瘤腫瘤細胞中的異常表達具有重要的功能和病理學意義,IgG和腦膠質(zhì)瘤的惡性轉(zhuǎn)化具有相關性。對這一現(xiàn)象的深入研究,將可能揭示免疫球蛋白新的生理和病理功能,對腫瘤的診斷、預后判斷以及靶向治療提供新的思路。
參考文獻
[1]CHEN Z,QIU X,GU J.Immunoglobulin expression in non-lymphoid lineage and neoplastic cells[J].Am J Pathol,2009,174(4):1139-1148.
[2]KYROU I E,PAPAKOSTAS J C,IOACHIM E,et al.Early ischaemic preconditioning of spinal cord enhanced the binding profile of heat shock protein 70 with neurofilaments and promoted its nuclear translocation after thoraco-abdominal aortic occlusion in pigs[J].Eur J Vasc Endovasc Surg,2012,43(4):408-414.
[3]XU Y,CHEN B,ZHENG S,et al.IgG silencing induces apoptosis and suppresses proliferation,migration and invasion in LNCaP prostate cancer cells[J].Cell Mol Biol Lett,2016,3(21):27.
[4]QIU X,ZHU X,ZHANG L,et al.Human epithelial cancers secrete immunoglobuling with unidentified specificity to promote growth and survival of tumor cells[J].Cancer Res,2003,(63):6488-6495.
[5]NIU N,ZHANG J,HUANG T,et al.IgG expression in human colorectal cancer and its relationship to cancer cell behaviors[J].PLoS One,2012,7(11):e47362.
[6]薛雨健,張杰,汪明玉,等.IgG在人腦膠質(zhì)瘤中的表達及其與OPN、MMP-2、MMP-9、P16的關系[J]. 解剖科學進展,2013,19(6):513-515,519.
[7]WANG Y,SHENG Q,SPILLMAN M A,et al.Gab2 regulates the migratory behaviors and E-cadherin expression via activation of the PI3K pathway in ovarian cancer cells[J].Oncogene,2012,31(20):2512-2520.
[8]XU X L,WANG X,CHEN Z L,et al.Overexpression of Grb2-associated binder 2 in human lung cancer[J].Int J Biol Sci,2011,7(5):496-504.
[9]MATSUMURA T,SUGIMACHI K,TAKAHASHI Y,et al.Clinical significance of GAB2,a scaffolding/docking protein acting downstream of EGFR in human colorectal cancer[J].Ann Surg Oncol,2014,21(Suppl 4):S743-S749.
[10]MA J,YU J,LIU J,et al.MicroRNA-302a targets GAB2 to suppress cell proliferation,migration and invasion of glioma[J].Oncol Rep,2017,37(2):1159-1167.
[11]孫磊,劉雨清,李小龍,等.Gab2-Akt-ARK5通路在膠質(zhì)瘤侵襲中的研究[J].中國腫瘤臨床,2014,41(9):551-554.
[12]田紅艷,陳萍萍,李笑,等.Gab2通過PI3K/Akt/ARK5/MMP途徑影響乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[J].中國藥理學通報,2015,31(7):1014-1018.
[13]CHAGPAR R B,LINKS P H,PASTOR M C,et al.Direct positive regulation of PTEN by the p85 subunit of phosphatidylinositol 3-kinase[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(12):5471-5476.
[14]江克華,董自強,宋興福,等.PI3K/PTEN信號通路與腫瘤血管形成關系的研究進展[J].實用醫(yī)學雜志,2011,27(22):4169-4170.
[15]STEELMAN L S,CHAPPELL W H,ABRAMS S L,et al.Roles ofthe Raf/MEK/ERK and PI3K/PTEN/Akt/mTOR pathways in controlling growth and sensitivity to therapy-implications for cancer and aging[J].Aging(Albany NY),2011,3(3):192-222.