◎ 沈津宇，倪 瑩，高 璐

（揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，簡(jiǎn)稱V.p），是海洋生物中常見(jiàn)的病原菌，也是引起人類腸道疾病的一種食源性致病菌，革蘭氏陰性、嗜鹽、無(wú)芽孢、無(wú)莢膜、有極生鞭毛、運(yùn)動(dòng)活潑，菌體呈弧狀、桿狀或絲狀等，最適培養(yǎng)基含鹽量為2%～4%，低于0.5%或高于10%的鹽度環(huán)境下難以生長(zhǎng)[1-3]。

食品的儲(chǔ)運(yùn)加工過(guò)程中，多種處理方法可能會(huì)使食源性致病菌處于不利生存環(huán)境。研究表明，大多數(shù)細(xì)菌能對(duì)這種不利生存環(huán)境作出應(yīng)激響應(yīng)，使其保持一定的代謝活性和致病能力并維持生存。當(dāng)環(huán)境條件適合其生長(zhǎng)，細(xì)菌將迅速修復(fù)并繁殖，因此對(duì)食品的安全造成了極大的隱患[4-5]。

本文分析了耐低鹽和耐高鹽副溶血性弧菌分離株在含0.6%、3%、8%NaCl的APW中生物被膜生成力、溶血素活力、產(chǎn)胞外蛋白酶的能力，旨在探究不同菌株在應(yīng)對(duì)環(huán)境中鹽度變化時(shí)的響應(yīng)能力，為副溶血性弧菌應(yīng)對(duì)不利條件脅迫響應(yīng)機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

本研究所用副溶血性弧菌菌株YZHY003、YZHY005、YZHY019、YZHY020、YZHY027、YZHY028和YZHY033均分離自水產(chǎn)品，由揚(yáng)州大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室分離并保藏。

硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖（TCBS）瓊脂培養(yǎng)基、氯化鈉堿性蛋白胨水（APW）培養(yǎng)基，均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T-6紫外分光光度計(jì)（菲勒儀器有限公司），TG16A型臺(tái)式離心機(jī)（湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司），SX-500型高壓蒸汽滅菌鍋（日本TOMMY公司），YRH-800F生化培養(yǎng)箱（上海姚氏儀器設(shè)備廠），Heraguard? ECO超凈工作臺(tái)（Thermo Fisher公司），M200多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)室保存的副溶血性弧菌分離株經(jīng)3% APW（pH7.5）中，37 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜；劃線于TCBS平板，挑取綠色、光滑的典型菌落，接種于APW中，37 ℃、120 r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng)；吸取菌液于1.5 mL滅菌離心管中，8 000 r/min離心5 min，棄上清，用滅菌生理鹽水重懸，調(diào)整菌液OD600至0.6，制得菌懸液備用。

1.3.2 耐高鹽、低鹽菌株的篩選

分別配制0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%和1.0%NaCl的APW作為低鹽度篩選條件，5%、6%、7%、8%、9%和10% NaCl的APW作為高鹽度篩選條件，用檸檬酸調(diào)整APW的pH至7.0。

吸取100 μL各分離株菌體懸液，分別接種于10 mL各鹽度APW中，每個(gè)條件設(shè)置3個(gè)平行樣，37 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)24 h；選取在最低NaCl濃度和最高NaCl濃度中能生長(zhǎng)（OD600＞0.3）的菌株作為后續(xù)研究用菌株。

1.3.3 生物被膜生成情況測(cè)定[6]

選取菌株分別接種于0.6%、3%和8% NaCl的APW上，37℃、120 r/min搖床培養(yǎng)24 h后，調(diào)整菌液OD600至0.8左右，以200 μL/孔加入96孔板，每組9個(gè)平行，無(wú)菌APW作空白對(duì)照；25 ℃靜置培養(yǎng)3 d，隔天換液；吸出菌液，滅菌生理鹽水清洗2次；以200 μL/孔加入0.1%結(jié)晶紫染色，靜置5 min后吸出液體，滅菌生理鹽水清洗3次后于60 ℃恒溫干燥10 min；以200 μL/孔加入33%冰醋酸，靜置10 min后用酶標(biāo)儀測(cè)OD630。各菌株OD630減去陰性對(duì)照OD630，定義增加0.001為一個(gè)活力單位（U）。

1.3.4 溶血素活力測(cè)定[6]

采集新鮮雞血制備10%紅細(xì)胞懸液，以100 μL/孔加入96孔板備用；各鹽度菌液離心取上清100 μL加入96孔板，每組9個(gè)平行，新鮮APW培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照，于37 ℃恒溫放置1 h后測(cè)OD540。各菌株OD540減去陰性對(duì)照OD540，定義減小0.001為一個(gè)活力單位（U）。

1.3.5 產(chǎn)胞外蛋白酶能力測(cè)定[6]

將酪蛋白1.0 g、酵母浸出粉0.2 g、NaCl 3.5 g溶解于100 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至8.5，制成A液；將3 g瓊脂溶解于50 mL蒸餾水，制成B液；A液、B液滅菌后立即混合，搖勻后，傾注平板，制成酪蛋白平板；各菌株經(jīng)0.6%、3%和8% NaCl APW培養(yǎng)后的菌液點(diǎn)種于酪蛋白平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，用盧戈氏碘液對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行染色，測(cè)定透明水解圈直徑/菌落直徑（D/d）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度對(duì)副溶血性弧菌生長(zhǎng)的影響

副溶血性弧菌分離株在不同鹽度APW中的生長(zhǎng)情況如圖1所示，隨著鹽度的增加（＞6% NaCl）或降低（＜1.0% NaCl），弧菌菌株的生長(zhǎng)能力逐漸降低（OD600下降），但不同菌株的差異明顯：有些菌株（如YZHY27）在低鹽度（0.5% NaCl）和較高鹽度（8%NaCl）范圍內(nèi)的APW中均能生長(zhǎng)（OD600＞0.3）；有些菌株（如YZHY05、YZHY20）在較低鹽度（0.5%NaCl）和較高鹽度（8% NaCl）范圍內(nèi)的APW中均不能較好生長(zhǎng)（OD600＜0.3）；有些菌株（如YZHY28）在較低鹽度（0.6% NaCl）的APW中幾乎不生長(zhǎng)（OD600＜0.3），而在較高鹽度（8% NaCl）的APW中生長(zhǎng)較其他菌株好（OD600＞0.3）。不同耐鹽菌株YZHY27、YZHY05進(jìn)行后續(xù)菌株生物學(xué)特性研究。

圖1 副溶血性弧菌菌株在各鹽度APW中生長(zhǎng)情況圖

2.2 生物被膜生成能力

在不同鹽度培養(yǎng)條件下，副溶血性弧菌菌株生物被膜生成能力如圖2所示，耐鹽能力不同的兩株分離株的生物被膜生成能力有所差異，但差異不明顯。兩菌株在含3% NaCl的最適鹽度APW中生物被膜生成能力最強(qiáng)，而在低鹽度（0.6% NaCl）和較高鹽度（8% NaCl）條件下成膜能力明顯降低，與3% NaCl條件相比差異顯著，說(shuō)明鹽度對(duì)副溶血性弧菌的生物被膜生成能力有明顯影響，這與渠宏雁等[7]的研究結(jié)果基本一致。

圖2 生物被膜生成能力圖

2.3 溶血素活力

副溶血性弧菌的溶血素與其致病力有關(guān)[8]，菌株在不同鹽度培養(yǎng)基中溶血素活力如圖3所示。耐鹽能力不同的兩株分離株的溶血素活力也不同，但差異不明顯。兩菌株在含3% NaCl的最適鹽度APW中溶血素活力最強(qiáng)，而在低鹽度（0.6% NaCl）和較高鹽度（8% NaCl）條件下活力明顯降低，與3% NaCl條件相比差異顯著，說(shuō)明鹽度對(duì)副溶血性弧菌的溶血素活力有明顯影響。

圖3 溶血素活性測(cè)定結(jié)果圖

2.4 產(chǎn)胞外蛋白酶能力

在不同鹽度培養(yǎng)基中，副溶血性弧菌菌株產(chǎn)胞外蛋白酶能力如圖4所示。耐鹽能力不同的兩株分離株在低鹽度（0.6% NaCl）、高鹽度（8% NaCl）和最適鹽度（3% NaCl）的APW中產(chǎn)胞外蛋白酶能力有所差異但差異不顯著。說(shuō)明鹽度對(duì)副溶血性弧菌的產(chǎn)胞外蛋白酶能力沒(méi)有明顯影響。

圖4 產(chǎn)胞外蛋白酶能力圖

3 結(jié)論

不同副溶血性弧菌分離株對(duì)鹽的耐受能力有著明顯的差異，有些菌株能在較低和（或）較高鹽度條件下生長(zhǎng)，有些則不能。所選的兩菌株的生物被膜生成能力和溶血素活力均表現(xiàn)為在最適鹽度下能力最強(qiáng)，在低鹽或高鹽條件下能力明顯減弱，而其產(chǎn)胞外蛋白酶能力沒(méi)有明顯影響。

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