◎ 肖路遙，陳家輝，印曉玉，薛淑楠，劉 延，蔣棟磊

（揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127）

隨著食品工業(yè)的不斷發(fā)展，食品污染引起的疾病逐漸增多[1]。其中，多環(huán)芳烴（PAHs）的污染尤為嚴(yán)重。PAHs是一種稠合芳香環(huán)烴化合物，具有致癌潛力。許多研究已經(jīng)證明[2-4]，肺癌、心臟病發(fā)病率的增加都與PAHs有關(guān)系。BaP往往在加工過程中產(chǎn)生，食品本身很少含有這種物質(zhì)[5-6]。BaP被人體攝入后，被腸道吸收，最后通過血液循環(huán)遍布全身，對(duì)人體產(chǎn)生危害[7]。研究表明[8-9]，BaP具有強(qiáng)烈的致癌性、致病性，包括改變DNA甲基化、改變組蛋白乙酰化、引起細(xì)胞周期紊亂和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。本文以BaP為研究對(duì)象，通過檢測細(xì)胞Ca2+水平和活性變化，篩選出對(duì)于識(shí)別BaP更敏感的細(xì)胞株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PC-12神經(jīng)細(xì)胞、RAW 264.7巨噬細(xì)胞、RBL-2H3肥大細(xì)胞：中科院上海細(xì)胞庫；苯并(a)芘[Benzo(a)pyrene，BaP]：上海阿拉丁生化技術(shù)有限公司；Fluo-4 AM 5 mM、MTT細(xì)胞毒性及增殖檢測試劑盒：碧云天生物技術(shù)有限公司；酶標(biāo)儀、倒置熒光顯微鏡：美國Thermo Fisher電子公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MTT實(shí)驗(yàn)

加入100 μL重懸細(xì)胞于96孔板中，每孔約5 000個(gè)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞完全貼壁。依次加入10 μL濃度為10～50 μmol/L的BaP，不加BaP的細(xì)胞為空白對(duì)照。每孔依次加入10 μL MTT溶液，37 ℃繼續(xù)孵育。孵育結(jié)束后，依次加入100 μL Formazan溶解液，繼續(xù)孵育。光學(xué)顯微鏡下觀察紫色Formazan結(jié)晶是否全部溶解。用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸光度。細(xì)胞活力（cell viability）的公式如下：

式中，A（加藥）為添加BaP刺激的細(xì)胞孔板的OD值；A（調(diào)零）為沒有細(xì)胞和BaP孔板的OD值；A（空白對(duì)照）為沒有BaP刺激細(xì)胞孔板的OD值。

1.2.2 Ca2+熒光

加入100 μL重懸細(xì)胞于96孔板中，37 ℃培養(yǎng)使細(xì)胞完全貼壁，用PBS分別清洗細(xì)胞3次以防止培養(yǎng)液降解Fluo-4 AM。稀釋Fluo-4 AM母液到濃度為1 μmol/L，加入孔板后孵育30 min以完成熒光探針的裝載。裝載完成后，用PBS洗滌細(xì)胞2～3次，37 ℃再次孵育30 min，使Fluo-4 AM轉(zhuǎn)變成Fluo-4。依次加入10 μL濃度為10～50 μmol/L的BaP，將不加BaP刺激的細(xì)胞作為空白對(duì)照，37 ℃下孵育12 h。用倒置熒光顯微鏡拍攝鈣離子熒光圖，酶標(biāo)儀用來測定熒光強(qiáng)度，設(shè)定的激發(fā)波長為460 nm，發(fā)射波長為520 nm。不同濃度BaP刺激后的熒光強(qiáng)度與該細(xì)胞空白對(duì)照的比值（F/F0）為相對(duì)熒光強(qiáng)度，用來表示對(duì)應(yīng)的Ca2+濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 BaP對(duì)不同細(xì)胞活力影響的探究

圖1表明，不同濃度的BaP均能不同程度的抑制3種細(xì)胞的活力。BaP的濃度為50 μmol/L時(shí)，對(duì)3種細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)。與空白對(duì)照組相比，3種細(xì)胞的活力分別降低29.72%、15.81%和19.66%。BaP濃度為10 μmol/L時(shí)，3種細(xì)胞活力的抑制作用較小，此時(shí)對(duì)PC-12細(xì)胞活力的抑制最明顯，為18.7%。結(jié)果表明，BaP對(duì)PC-12細(xì)胞活力的抑制效果更強(qiáng)，且在一定范圍內(nèi)，BaP的濃度越高，抑制效果越明顯。

圖1 BaP對(duì)PC-12、RAW 264.7和RBL-2H3細(xì)胞活力的影響圖

2.2 BaP對(duì)不同細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化與細(xì)胞凋亡有著緊密的聯(lián)系[10]。圖2中，A、C、E為不添加BaP的對(duì)照組；B、D、F為10 μmol/L BaP處理后的PC-12、RAW 264.7和RBL-2H3細(xì)胞。3種細(xì)胞在10 μmol/L的BaP處理后均出現(xiàn)明顯的熒光點(diǎn)。相比于其他兩種細(xì)胞，PC-12細(xì)胞的熒光更為強(qiáng)烈。實(shí)驗(yàn)表明，3種細(xì)胞的Ca2+濃度在BaP處理后均升高，PC-12細(xì)胞的Ca2+濃度變化更為明顯。

圖2 BaP對(duì)PC-12、RAW 264.7和RBL-2H3細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的影響圖

圖3表明，不同濃度的BaP均能顯著改變胞內(nèi)Ca2+的濃度。PC-12熒光強(qiáng)度的變化更為強(qiáng)烈，抑制作用更明顯。已有相關(guān)的研究表明，BaP能影響胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。運(yùn)用SPSS對(duì)3種細(xì)胞的細(xì)胞活力與熒光強(qiáng)度之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，得出PC-12細(xì)胞的兩者相關(guān)系數(shù)為-0.880 7，RAW 264.7細(xì)胞為-0.413 1，而RBL-2H3細(xì)胞為-0.669 2，所以PC-12細(xì)胞更敏感。

圖3 BaP對(duì)PC-12、RAW 264.7和RBL-2H3細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的影響圖

3 結(jié)論

結(jié)果表明，PC-12神經(jīng)細(xì)胞活力與Ca2+濃度變化之間的相關(guān)性更高，說明PC-12神經(jīng)細(xì)胞對(duì)于BaP更靈敏。為今后對(duì)于BaP在細(xì)胞方向上的研究奠定了基礎(chǔ)。

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