杜文霞

(河南省中醫(yī)院 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450002)

圍絕經(jīng)期綜合征是婦女在圍絕經(jīng)期由于雌激素分泌減少導(dǎo)致的一系列癥狀的癥候群〔1～3〕，常用治療方法為雌激素替代療法，以緩解其圍絕經(jīng)期癥狀，療效已得到肯定，但易增加子宮出血、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌的發(fā)生率〔4，5〕。祖國中醫(yī)認(rèn)為發(fā)生圍絕經(jīng)期綜合征的主要原因是腎虛、肝郁、脾虛。中藥益坤寧是一種由多味中藥材熬制而成的中藥制劑，具有補腎、疏肝、健脾的功效，能顯著改善圍絕經(jīng)期綜合征的相關(guān)癥狀〔6〕。本研究擬探討益坤寧對圍絕經(jīng)期大鼠卵巢雌激素受體(ER)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3及細(xì)胞凋亡率的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取30只13～14月齡雌性Wistar大鼠，體重290～328 g，平均(311.4±11.7)g；另選取10只5月齡且有規(guī)律動情周期的雌性Wistar大鼠，體重176～209 g，平均(194.6±6.8)g。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20℃，濕度58%，每天給予12 h光照時間，自由飲食飲水。實驗大鼠均由河南省中醫(yī)院提供，合格證號：SYXK(豫)2016-0009。

1.2實驗試劑與儀器 TUNEL試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液、Trizol試劑購自羅氏公司，蛋白酶K、3%H2O2、轉(zhuǎn)化劑POD購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，caspase-3、ERα、ERβ抗體均購自美國Santa Cruz公司，光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3藥劑制備 中藥益坤寧主要成分：熟地30 g、黃芪30 g、山茱萸30 g、柴胡15 g、桂枝15 g、牡蠣30 g、麥冬20 g、當(dāng)歸20 g、甘草15 g、白芍20 g、龍骨30 g、茯苓20 g。所有藥材經(jīng)專家鑒定均符合中國藥典2005年版的規(guī)定，將其制成水煎劑，高壓密封后備用。

1.4建模及分組 30只13～14月齡大鼠經(jīng)過連續(xù)15 d的陰道脫落細(xì)胞涂片檢查確定存在動情周期紊亂、動情周期延長的現(xiàn)象，可作為圍絕經(jīng)期大鼠模型；按照隨機數(shù)字表法分為模型組(10只)、替勃龍片(利維愛)組(10只)、益坤寧組(10只)。5月齡的大鼠納入對照組(10只)。益坤寧組每天給予益坤寧1.12 g/kg，利維愛組每天予利維愛(荷蘭N.V.Organon，注冊證號：H20160575，規(guī)格：2.5 mg)0.26 g/kg，模型組和對照組每天予3 ml生理鹽水。四組大鼠均連續(xù)灌胃給藥4 w。

1.5細(xì)胞凋亡測定 在末次給藥后1 d將所有大鼠斷頭處死，取出雙側(cè)卵巢，取部分卵巢組織置入4 %多聚甲醛中固定，進行常規(guī)的石蠟包埋切片，切片厚度為5 μm。采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況。二甲苯脫蠟處理，無水乙醇5 min、90%乙醇2 min、70%乙醇2 min、蒸餾水2 min，滴加20 μg/ml蛋白酶K(10 mmol/L Tris，HCl稀釋)，在室溫下放入濕盒中作用15～ 30 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次5 min。在切片上滴加50 μl新鮮配制 TUNEL反應(yīng)混合物，在室溫下放入濕盒中作用孵育1 h。PBS沖洗3次，每次5 min。3%H2O2甲醇液室溫阻斷10 min，室溫孵育90 min，在切片上滴加50 μl POD，在室溫下放入濕盒中作用30 min。PBS沖洗3次，每次5 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染。梯度乙醇中行常規(guī)脫水，二甲苯透明處理，滴加少量中性樹膠，封片晾干。采用光學(xué)顯微鏡進行觀察，細(xì)胞核呈棕黃色者為陽性凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核呈藍色者為陰性非凋亡細(xì)胞。采用JD-801顯微圖像分析系統(tǒng)進行圖像采集，并分析細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=染色陽性面積/視野總面積×100%。

1.6逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測各組大鼠caspase-3、ERα、ERβ mRNA表達 采用Trizol試劑提取卵巢組織中的總RNA，采用紫外可見分光光度計測定吸光度OD260 。取2.5 μg總RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。采用Gene Runner軟件設(shè)計大鼠caspase-3、ERα、ERβ的引物序列。caspase-3上游引物：5′-TCTGACTGGAAAGCCGAAACTC-3′，下游引物：5′-ACGGGATCTGTTTCTTTGCATG-3′，長度341 bp；ERα上游引物：5′-ACCAAAGCCTCGGGAATG-3′，下游引物：5′-GCTCGTTCTCCAGGTAGTAGGG-3′,長度403 bp；ERβ上游引物：5′-GAGCTCAGCCTGTTGGACC-3′，ERβ下游引物：5′-GGCCTTCACACAGAGATACTCC-3′，長度246 bp。以β-actin為內(nèi)參，上游引物：5′-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，下游引物：5′-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3′，長度511 bp。PCR 擴增：(1)變性：94℃，1 min ；(2)退火：55℃，1 min；(3)延伸：72℃，1 min。將擴增產(chǎn)物置于1.5%瓊脂糖中進行凝膠電泳，GIS凝膠成像系統(tǒng)分析電泳條帶。caspase-3、ERα、ERβ的相對表達量以其與β-actin灰度比值表示。

1.7蛋白印跡法檢測各組大鼠caspase-3、ERα、ERβ蛋白表達 提取大鼠卵巢總蛋白,取適量樣品，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移于聚偏二氟乙烯膜上，加入3%BSA封閉60 min，加入稀釋好的一抗(caspase-3、ERα、ERβ)，37℃孵育60 min。TTBS緩沖液清洗3 次，每次10 min，TBS洗膜10 min。加入用ALP標(biāo)記的IgG，37℃孵育1 h，用TTBS緩沖液清洗3 次，每次10 min，TBS洗膜10 min。GIS凝膠成像系統(tǒng)分析電泳條帶，采用β-actin作為內(nèi)參。caspase-3、ERα、ERβ蛋白表達水平以其與β-actin灰度比值表示。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件行t檢驗及單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1四組細(xì)胞凋亡率比較 四組細(xì)胞凋亡率整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。益坤寧組〔(9.24±1.61)%〕、利維愛組〔(9.13±1.42)%〕、對照組〔(9.26±1.28)%〕顯著低于模型組〔(17.96±3.67)%〕(P<0.05)；益坤寧組、利維愛組、對照組兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2四組卵巢組織caspase-3、ERα、ERβ mRNA比較 四組卵巢組織caspase-3、ERα、ERβ mRNA及蛋白水平整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。益坤寧組、利維愛組、對照組的caspase-3 mRNA及蛋白水平顯著低于模型組，ERα、ERβ mRNA及蛋白水平顯著高于模型組(P<0.05)；益坤寧組、利維愛組caspase-3、ERα、ERβ mRNA均高于對照組，caspase-3蛋白表達明顯高于對照組(P<0.05)；益坤寧組和利維愛組caspase-3、ERα、ERβ mRNA及蛋白水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 四組卵巢caspase-3、ERα、ERβ mRNA及蛋白比較

與模型組比較：1)P<0.05；與對照組比較：2)P<0.05

3 討 論

圍絕經(jīng)期婦女的卵巢功能明顯衰退，雌激素分泌減少分，血液中雌激素濃度也明顯降低，促卵泡激素(FSH)和黃體生成激素(LH)升高，導(dǎo)致下丘腦-垂體-卵巢軸之間出現(xiàn)失調(diào)，對自主神經(jīng)中樞及其控制的各臟器功能造成影響，從而導(dǎo)致一系列自主神經(jīng)功能失調(diào)的癥狀出現(xiàn)〔7，8〕。利維愛是一種具有弱雌激素、雄激素和孕激素活性的甾體激素，能明顯抑制圍絕經(jīng)期婦女血漿中促卵泡激素水平，對黃體生成素抑制較輕，常用于治療圍絕經(jīng)期綜合征〔9〕。中藥益坤寧具有補腎、疏肝、健脾的功效，可調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)，改善卵巢功能。相關(guān)研究顯示,卵巢功能衰退時卵泡中大量顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡,這可能是引起卵泡閉鎖 、卵泡發(fā)育停止的重要因素。卵巢功能衰退的嚴(yán)重程度與卵巢內(nèi)細(xì)胞凋亡率顯著相關(guān)〔10〕。結(jié)合結(jié)論可以推斷，中藥益坤寧具有預(yù)防和延緩卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞凋亡的作用，阻止卵泡閉鎖，獲取更多卵泡，進而增加雌激素的分泌量，這可能是益坤寧治療圍絕經(jīng)期綜合征的機制之一。在細(xì)胞凋亡中caspase家族具有重要的作用，caspase-3是凋亡過程中最關(guān)鍵的功能蛋白酶，在整個凋亡過程中會多次被激活，同時可以激活下游的細(xì)胞死亡蛋白酶。在細(xì)胞凋亡末期的細(xì)胞裂解及凋亡小體形成的過程中，caspase-3必不可少〔11〕。由本研究結(jié)果可以推斷，益坤寧可對圍絕經(jīng)期大鼠卵巢中caspase-3基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯起到抑制作用，進而降低caspase-3功能蛋白酶的表達,達到抑制卵巢細(xì)胞凋亡的目的。圍絕經(jīng)期最大的變化就是雌激素分泌減少，雌激素通過與ER結(jié)合發(fā)揮其生物作用，因此ER的數(shù)量能直接影響雌激素發(fā)揮作用的大小。ER主要有ERα、ERβ兩組亞型，它們在人體內(nèi)廣泛分布。ERα、ERβ對于維持卵巢正常功能是必不可少的，對卵泡、卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟具有重要的作用〔12〕。本研究顯示益坤寧能上調(diào)圍絕經(jīng)期大鼠卵巢中ERα、ERβ的表達，進而加強雌激素效應(yīng)，減緩卵巢衰退。

4 參考文獻

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