黃 立 方 強(qiáng)

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310003)

膿毒癥可發(fā)展為休克和多器官功能障礙綜合征(MODS)。凝血功能紊亂在膿毒癥發(fā)病過(guò)程中具有重要作用〔1，2〕。血小板是凝血系統(tǒng)的主要功能成分，膿毒癥發(fā)病時(shí)產(chǎn)生的大量炎癥介質(zhì)會(huì)促進(jìn)血小板活化，血小板α顆粒(PLT-α)釋放出血小板衍生因子(PDGF)-bb、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2等活性物質(zhì)，可進(jìn)一步加重凝血系統(tǒng)紊亂和炎癥損傷〔3〕。外源性一氧化碳釋放分子(Corm)Ⅱ可將攜帶的一氧化碳釋放入組織氣管中發(fā)揮作用〔4〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，CormⅡ可明顯抑制膿毒癥時(shí)大鼠體內(nèi)血小板的聚集、釋放及體內(nèi)炎癥反應(yīng)〔5〕。本研究旨在探討CormⅡ?qū)LT-α釋放的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 CormⅡ、脂多糖、兔抗人VAMP8單抗購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；鼠抗人FITC-CD41單抗、血小板P選擇素單抗、MUNC18a單抗均于上海科華生物工程股份有限公司；兔抗人p-PPKCδ單抗、p-PMUNC18a單抗購(gòu)于上海捷瑞生物工程有限公司；PDGF-bb、MMP-2試劑盒購(gòu)于南京森貝伽生物科技有限公司；PKCδ抑制劑LY317615購(gòu)于美國(guó)MCE公司。

1.2模型建立與分組 采集健康供血者空腹外周靜脈血30 ml，抗凝處理后1 500 r/min離心20 min，取上層富含血小板的血漿，隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組(不作處理)、脂多糖組(10 μmol/L脂多糖誘導(dǎo))、無(wú)活性CormⅡ組(脂多糖和30 μmol/L無(wú)活性CormⅡ誘導(dǎo))、10 μmol/L和30 μmol/L CormⅡ組(10 μmol/L脂多糖誘導(dǎo)的同時(shí)給予不同濃度CormⅡ誘導(dǎo))；各組均放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)PDGF-bb、MMP-2含量 取各組上清液用ELISA檢測(cè)PDGF-bb、MMP-2含量，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作；讀取酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)處吸光度值，計(jì)算其濃度。

1.3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板P選擇素表達(dá) 取樣品放入流式細(xì)胞儀試管中，在終濃度為10%的甲醛溶液固定20 min。向各組中分別加入FITC-CD41、血小板P選擇素單抗，室溫下暗室中反應(yīng)20 min，流式細(xì)胞儀通過(guò)單抗免疫標(biāo)記檢測(cè)呈陽(yáng)性的血小板比例。

1.3.3免疫熒光法檢測(cè)PLT-α分布情況 取各組細(xì)胞懸液放入2 ml離心管中，4℃ 2 000 r/min離心10 min，棄去上清，下層沉淀為血小板，室溫下10%的低聚甲醛固定30 min。磷酸緩沖液洗滌，標(biāo)本放于冰上用0.5%曲拉通X-100通透30 min，室溫下用1%牛血清白蛋白(BSA)封閉3 h。滴加兔抗人VAMP8單抗，4℃反應(yīng)過(guò)夜，次日滴加二抗，室溫下暗室中勻速搖晃60 min，磷酸緩沖液洗滌，4℃ 2 000 r/min離心10 min，棄去上清，重懸后在倒置顯微鏡下觀察PLT-α分布。

1.3.4Western印跡法檢測(cè)p-PKCδ、p-MUNC18a蛋白表達(dá)情況 為進(jìn)一步探討CormⅡ影響PLT-α釋放的作用機(jī)制，增加LY317615組(10 μmol/L脂多糖+100 nmol/L LY317615)、CormⅡ+LY317615組(10 μmol/L脂多糖+30 μmol/L CormⅡ+ 100 nmol/L LY317615)。采集30 ml外周靜脈血，分離得到上層富含血小板的血漿，隨機(jī)分為6組，每組含2.5 ml富含血小板的血漿，按上述處理：37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min。收集各組樣品，4℃ 2 000 r/min離心10 min，獲取血小板，加300 μl含磷酸酶、蛋白酶抑制劑的裂解液，冰上裂解40 min。4℃ 10 000 r/min離心10 min，棄去不溶物，測(cè)定蛋白濃度。加上樣緩沖液，煮沸10 min，冷藏保存。十二烷基硫酶鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、轉(zhuǎn)膜后室溫下封閉3 h，滴加兔抗人p-PKCδ單抗、p-PMUNC18a單抗，4℃孵育過(guò)夜，滴加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫下孵育3 h。洗滌后電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，測(cè)定條帶灰度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS21.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1CormⅡ?qū)χ嗵钦T導(dǎo)后PLT-α內(nèi)容物釋放的影響 脂多糖誘導(dǎo)后PLT-α釋放的PDGF-bb、MMP-2及血小板P選擇素表達(dá)水平均明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；無(wú)活性CormⅡ組PLT-α內(nèi)容物釋放及血小板P選擇素表達(dá)水平與脂多糖組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CormⅡ誘導(dǎo)后，PLT-α釋放的PDGF-bb、MMP-2明顯減少，血小板P選擇素表達(dá)水平明顯降低且呈劑量依賴性。見表1。

表1 CormⅡ?qū)χ嗵钦T導(dǎo)后PLT-α內(nèi)容物釋放的影響

與對(duì)照組相比：1)P<0.05；與脂多糖組相比：2)P<0.05

2.2CormⅡ?qū)χ嗵钦T導(dǎo)后PLT-α分布的影響 VAMP8單抗標(biāo)記的PLT-α免疫熒光檢測(cè)顯示，脂多糖誘導(dǎo)后中央?yún)^(qū)的PLT-α逐漸向血小板磷脂膜區(qū)轉(zhuǎn)移，與磷脂膜融合后釋放到血小板外；無(wú)活性CormⅡ組與脂多糖組PLT-α分布情況相似；CormⅡ誘導(dǎo)后PLT-α向血小板膜匯聚明顯減少。見圖1。

2.3CormⅡ?qū)ρ“錚KCδ活性的影響 脂多糖誘導(dǎo)后血小板PKCδ磷酸化(p-PKCδ)相對(duì)表達(dá)量為1.12±0.45，明顯高于對(duì)照組的0.55±0.17，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；無(wú)活性CormⅡ組p-PKCδ相對(duì)表達(dá)量為1.15±0.31，與脂多糖組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；LY317615組、CormⅡ組、CormⅡ+LY317615組p-PKCδ相對(duì)表達(dá)量分別為0.62±0.10、0.67±0.24、0.64±0.05，與脂多糖組和無(wú)活性CormⅡ組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.4CormⅡ?qū)ρ“錗UNC18a活性的影響 脂多糖誘導(dǎo)后血小板MUNC18a磷酸化(p-MUNC18a)相對(duì)表達(dá)量為2.41±0.28，明顯高于對(duì)照組的1.33±0.45，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；無(wú)活性CormⅡ組p-MUNC18a相對(duì)表達(dá)量為2.48±0.56，與脂多糖組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；LY317615組、CormⅡ組、CormⅡ+LY317615組p-MUNC18a相對(duì)表達(dá)量分別為1.62±0.49、1.59±0.17、1.40±0.13，與脂多糖組和無(wú)活性CormⅡ組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖1 VAMP8單抗標(biāo)記的各組PLT-α

1：對(duì)照組；2：LY317615組；3：脂多糖組；4：無(wú)活性CormⅡ組；5：CormⅡ組；6：CormⅡ+LY317615組；同下圖圖2 CormⅡ?qū)ρ“錚KCδ活性的影響

圖3 CormⅡ?qū)ρ“錗UNC18a活性的影響

3 討 論

膿毒癥發(fā)病過(guò)程中血小板異常活化具有重要作用，活化過(guò)程中還可刺激PLT-α釋放出PDGF-bb、MMP-2、P-選擇素等大量功能性蛋白分子。多種類型的活化分子在加速血小板活化的同時(shí)也加重了膿毒癥的炎性損傷〔6〕。動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)，CormⅡ分泌的一氧化碳可降低脂多糖誘導(dǎo)的血小板聚集、顆粒釋放等異?；罨?，而單純CormⅡ?qū)ρ“迳砉δ軣o(wú)明顯影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PLT-α內(nèi)容物在脂多糖誘導(dǎo)后釋放水平明顯提升，而CormⅡ干預(yù)可明顯降低內(nèi)容物的釋放量；進(jìn)一步通過(guò)免疫熒光觀察顯示，脂多糖誘導(dǎo)后中央?yún)^(qū)的PLT-α逐漸向血小板磷脂膜區(qū)轉(zhuǎn)移，與磷脂膜融合后釋放到血小板外，CormⅡ干預(yù)可有效緩解上述趨勢(shì)。

PKC家族是一種在哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛分布的蛋白激酶，目前共發(fā)現(xiàn)10種亞型，血小板中含有α、β、δ 3種亞型。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，PKCα、PKCβ是在血小板正常生理功能中發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用，將其敲除后會(huì)明顯降低血小板的分泌功能〔7〕；PKCδ主要調(diào)控血小板中致密顆粒的釋放，在PLT-α釋放中發(fā)揮作用〔8〕。SM蛋白是一系列親水性蛋白分子家族，可參與PLT-α釋放，已發(fā)現(xiàn)的釋放相關(guān)SM蛋白包括MUNC18a、MUNC18b。其中人和小鼠的血小板中均含有MUNC18a，其參與血小板復(fù)合物形成的調(diào)控〔9〕。相關(guān)基礎(chǔ)研究顯示，MUNC18a是PKCδ主要的下游信號(hào)分子，當(dāng)其活化后能夠?qū)UNC18a第207位絲氨酸磷酸化，促進(jìn)PLT-α的釋放〔10〕。本次研究顯示，脂多糖誘導(dǎo)后血小板PKCδ和MUNC18a磷酸化水平均增強(qiáng)，當(dāng)給予PKCδ特異性抑制劑LY317615和CormⅡ干預(yù)后，磷酸化水平受到明顯抑制。提示膿毒癥發(fā)病時(shí)脂多糖誘導(dǎo)血小板活化，引發(fā)血小板中PKCδ磷酸化，其活性增加可進(jìn)一步磷酸化下游MUNC18a，活化的MUNC18a可促進(jìn)PLT-α釋放。

綜上，膿毒癥發(fā)病時(shí)機(jī)體中血小板PKCδ/MUNC18a信號(hào)通路被激活，誘導(dǎo)PLT-α釋放量增加；通過(guò)CormⅡ釋放一氧化碳進(jìn)行干預(yù)，可行PKCδ/MUNC18a通路活化，降低PLT-α釋放，減弱膿毒癥損傷。

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