盧卓強 龔晶婧 蔡 翰 晉學慶

(福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，福建 福州 350005)

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)由腎素、血管緊張素原、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、血管緊張素(Ang)及其相應(yīng)的受體等構(gòu)成。它與高血壓、動脈粥樣硬化等老年人易患心腦血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)〔1〕。AngⅡ作為RAS的重要成員，大多由血管緊張素原先后經(jīng)腎素及ACE轉(zhuǎn)化生成，主要通過AngⅡ1型受體(AT1R)介導(dǎo)血管平滑肌細胞(VSMC)增殖、遷移，進而導(dǎo)致血管壁增厚，高血壓及動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生〔2，3〕。因此，目前臨床上ACE抑制劑(ACEI)及高選擇性血AT1R特異性阻斷劑(ARB)已經(jīng)成為臨床上高血壓及心血管疾病治療的關(guān)鍵藥物。ACE2、Ang作為RAS系統(tǒng)中一個新成員，主要通過降解AngⅡ生成Ang-(1～7)，后者作用于Mas受體，發(fā)揮擴張血管、抑制VSMC增殖、抗氧化應(yīng)激等與AngⅡ相拮抗的作用，從而調(diào)節(jié)心血管、腎臟功能，降低血壓和心血管事件，已成為心血管疾病治療的新靶點〔4,5〕。因此，RAS中存在ACE-AngⅡ-AT1受體軸與ACE2-Ang-(1～7)-Mas軸這2條存在相抗衡作用的生理學分支〔6,7〕，其作用相互拮抗并維持心血管系統(tǒng)的平衡。Koka等〔8〕在研究人體心臟時發(fā)現(xiàn)AngⅡ通過AT1R及其下游信號分子EPK1/2和p38MAP上調(diào)ACE并下調(diào)ACE2的表達。Xia等〔9〕發(fā)現(xiàn)在高血壓大鼠中樞中AT1R抑制ACE2的表達及活性升高，從而損害血管壓力反射功能導(dǎo)致血壓升高。本課題組早期研究提示ACE2基因轉(zhuǎn)染能有效抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC異常增殖〔10〕，但ACE2是通過何種途徑發(fā)揮上述作用尚不明確。雖然人們對ACE2及AT1R間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進行不斷研究，但是并未發(fā)現(xiàn)ACE2能夠直接作用于AT1R的證據(jù)，更多是間接參與AT1R的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。鑒于現(xiàn)有RAS成員互相作用的大量證據(jù)及AT1R在AngⅡ致異常增殖中的關(guān)鍵作用，本課題組假設(shè)ACE2基因轉(zhuǎn)染有可能直接對AT1R表達產(chǎn)生影響從而抑制VSMC異常增殖。本研究擬通過ACE2基因轉(zhuǎn)染大鼠胸主動脈平滑肌細胞，研究在AngⅡ、ATR1拮抗劑厄貝沙坦干預(yù)等不同情況下ACE2對AT1R mRNA及蛋白表達的影響，以闡明ACE2拮抗AngⅡ的生物學作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑、試劑盒和儀器 細胞培養(yǎng)液DMEM和胎牛血清、Trizol試劑、高保真DNA聚合酶、Lipofectamine2000(Invitrogen公司)。SP超敏試劑盒(兔)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，兔抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體(上海前塵生物科技有限公司)，厄貝沙坦(江蘇揚子江藥業(yè)公司)，AngⅡ(Sigma公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Stratagen公司)，AT1R兔抗大鼠一抗(Abcam公司)，β-actin小鼠抗大鼠一抗(Santa Cruz公司)，山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗(Santa Cruz公司)。PE-4800型PCR擴增儀(Perkin Elmer公司)。FR-250電泳儀(上海復(fù)日科技有限公司)。凝膠成像系統(tǒng)Biosens 810(上海山富科學儀器有限公司)。Biomate 5核酸蛋白定量測定儀(Thermo公司)。

1.2實驗動物及質(zhì)粒 體重為120～130 g普通SD成年大鼠，雌雄不限(福建醫(yī)科大學實驗動物中心)，質(zhì)粒pcDNA3.1/Hygro(+)(福建醫(yī)科大學分子醫(yī)學研究中心惠贈)及質(zhì)粒pm-ACE2(本課題組早期實驗構(gòu)建)〔11〕。

1.3SD大鼠胸主動脈VSMC的培養(yǎng)和鑒定 采用組織貼塊法進行VSMC培養(yǎng)〔12〕。首先應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察細胞大小、形態(tài)、生長特點及排列方式初步鑒定。再通過免疫細胞化學法鑒定VSMC：將第3代對數(shù)生長期的細胞5×104/孔接種到(預(yù)先放置蓋玻片)6孔板中，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取出蓋玻片,漂洗，4%多聚甲醛固定，加內(nèi)源性過氧化酶阻斷溶液后加正常動物非免疫血清(羊)，室溫下孵育10 min。加兔抗大鼠平滑肌肌動蛋白單克隆抗體(α-actin 1∶200)，4℃孵育過夜，加生物素標記的羊抗兔IgG，室溫下孵育10 min，爬片加鏈霉素抗生物素-過氧化酶，室溫下孵育10 min，加新鮮配制DAB溶液，顯微鏡下觀察3～10 min。蘇木素染色，自來水沖洗，梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。

1.4ACE2基因轉(zhuǎn)染、AngⅡ及厄貝沙坦等不同方法干預(yù)VSMC 取第5代VSMC以5×105/孔種植于6孔板中，每孔加入2 ml含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，37℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中至細胞長滿培養(yǎng)板70%～80%。隨機將細胞分組為：對照組、pcDNA3.1/Hygro(+)組、AngⅡ組、pm-ACE2組、厄貝沙坦組、AngⅡ+pm-ACE2組，AngⅡ+厄貝沙坦組、pm-ACE2+厄貝沙坦組和AngⅡ+pm-ACE2+厄貝沙坦組。根據(jù)實驗分組及Lipofetamine2000脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染操作要求分別將4 μg DNA〔pcDNA3.1/Hygro(+)或pm-ACE2〕轉(zhuǎn)染至pcDNA3.1/Hygro(+)組、pm-ACE2組、AngⅡ+pm-ACE2組、pm-ACE2+厄貝沙坦組和AngⅡ+pm-ACE2組+厄貝沙坦組，其余各組在上述組別轉(zhuǎn)染時亦使用相同劑量Lipofetamine2000同時處理以減小脂質(zhì)體毒性對實驗結(jié)果產(chǎn)生的影響。轉(zhuǎn)染后將細胞置于37℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后更換為完全培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)40 h后在厄貝沙坦組、AngⅡ+厄貝沙坦組、pm-ACE2+厄貝沙坦組和AngⅡ+pm-ACE2組+厄貝沙坦組分別加入厄貝沙坦(終濃度10-7mol/L)，而48 h后加AngⅡ(終濃度10-7mol/L)至AngⅡ組、AngⅡ+pm-ACE2組，AngⅡ+厄貝沙坦組、AngⅡ+pm-ACE2組+厄貝沙坦組，待AngⅡ干預(yù)12 h后用0.1%胰蛋白酶、0.1%EDTA消化，收集細胞。

1.5逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)測定各組AT1R mRNA的表達 將收集的VSMC按照Trizol試劑盒說明書按步驟常規(guī)提取總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，在20 μl反應(yīng)體系中加入1.5 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。根據(jù)NCBI網(wǎng)上SD大鼠AT1R基因及β-actin全長編碼序列(NC_005116.4和NC_005111.4)，用Oligo6.0設(shè)計SD大鼠AT1R基因及β-actin的引物序列送Invitrogen公司合成。AT1R擴增長度為142 bp,上游引物：5′-CCATCGTCCACCCAATGAAG-3′，下游引物：5′-TTGGTGTTCTCGATGAAGTATAC-3，β-actin擴增長度為227 bp,上游引物：5′-GAAATCGTGCGTGACATTA-3′，下游引物：5′-TAGGAGCCAGGGCAGTAA-3′。通過所獲得的cDNA及引物進行PCR，PCR的反應(yīng)條件：94℃逆轉(zhuǎn)錄5 min后，94℃變性30 s、55℃退火30 s、68℃延伸5 min循環(huán)30次，最后68℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳成像，在White/Ultraviolet Transilluminator凝膠成像分析系統(tǒng)下進行觀察并拍攝電泳圖像。測定各條帶IOD值，以β-actin表達量為基準，計算AT1R/β-actin表示各基因的相對表達量。

1.6Western印跡測定各組AT1R蛋白表達 取第5代平滑肌細胞按1×105/孔種植于6孔板中，實驗分組及各組干預(yù)方法同前，待AngⅡ干預(yù)12 h后用0.1%胰蛋白酶、0.1%EDTA消化。在各孔中加入RIPA細胞裂解液，提取總蛋白。取各組蛋白樣本進樣于制好的8%的SDS丙烯酰胺中，電泳、轉(zhuǎn)膜。5%的脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入兔抗大鼠ATIR(1∶1 000)，4℃過夜，用含(1∶1 000)吐溫的Tris緩沖液(TBST，pH=7.4)洗膜3次，每次10 min。加入山羊抗兔二抗(1∶2 000)，室溫培育1 h，TBST洗3次，每次10 min。顯色、曝光，經(jīng)Quantity one軟件分析吸光度值(A值)，并將其與內(nèi)參照的比值進行半定量分析。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析及LSD檢驗。

2 結(jié) 果

2.1VMSC體外培養(yǎng)及鑒定結(jié)果 細胞形態(tài)學：原代培養(yǎng)第5～7天可見細胞從組織塊邊緣游出，進而形成細胞簇，此時細胞形態(tài)多樣(梭形、不規(guī)則形)。細胞形態(tài)多呈寬大的長梭形，至培養(yǎng)2～3 w局部成束的細胞平行排列，部分區(qū)域細胞多層重疊，部分區(qū)域高低起伏呈“峰、谷”狀生長(圖1)。免疫細胞化學鑒定：培養(yǎng)第3代的細胞經(jīng)特異的兔抗大鼠α-actin抗體免疫組織化學染色胞質(zhì)著色為棕黃色，呈陽性反應(yīng)(圖2)，該結(jié)果提示細胞為典型的VSMC。

圖1 體外培養(yǎng)的VMSC(×100)

圖2 體外培養(yǎng)的VMSC鑒定(×200)

2.2AngⅡ、厄貝沙坦和ACE2基因轉(zhuǎn)染干預(yù)VSMC后對AT1R mRNA表達的影響 RT-PCR分析結(jié)果顯示(表1，圖3)：與對照組相比，AngⅡ干預(yù)VSMC后AT1R mRNA的表達明顯增加(P<0.05)，而ACE2轉(zhuǎn)染及厄貝沙坦干預(yù)VSMC后AT1R mRNA的表達均明顯減少(P<0.05)，ACE2轉(zhuǎn)染和厄貝沙坦同時干預(yù)VSMC能進一步抑制AT1R mRNA表達。ACE2轉(zhuǎn)染VSMC后能明顯抑制AngⅡ所誘導(dǎo)AT1R mRNA的表達(P<0.05)。厄貝沙坦干預(yù)VSMC后亦能明顯抑制AngⅡ所誘導(dǎo)AT1R mRNA的表達(P<0.05)。ACE2和厄貝沙坦共同干預(yù)后能協(xié)同抑制AngⅡ所誘導(dǎo)AT1R mRNA的表達(P<0.01)。

2.3AngⅡ、厄貝沙坦和ACE2基因轉(zhuǎn)染干預(yù)VSMC后對AT1R蛋白表達的影響 Western印跡結(jié)果顯示(圖4，表1)：AngⅡ干預(yù)后AT1R蛋白的表達較對照組明顯增加(P<0.05)，ACE2轉(zhuǎn)染及厄貝沙坦干預(yù)則使VSMC AT1R蛋白的表達較對照組明顯減少(P<0.05)，ACE2轉(zhuǎn)染VSMC后能抑制AngⅡ誘導(dǎo)AT1R蛋白表達的作用。厄貝沙坦干預(yù)VSMC后亦能明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)AT1R蛋白表達的作用(P<0.05)。另外,還發(fā)現(xiàn)不論有否AngⅡ干預(yù)情況下，ACE2基因轉(zhuǎn)染后均能明顯增強厄貝沙坦對AT1R蛋白表達的抑制作用，說明ACE2對厄貝沙坦的抑制AT1R蛋白表達作用具有協(xié)同或增強作用(P<0.05)。

表1 RT-PCR及Western印跡法檢測不同方法干預(yù)VSMC后AT1R mRNA及蛋白的表達

與對照組比較：1)P<0.05；2)P<0.01；與厄貝沙坦組比較：3)P<0.05，與AngⅡ組比較：4)P<0.05，5)P<0.01；與AngⅡ+厄貝沙坦組比較：6)P<0.05

M:Marker;A:對照組;B:pcDNA3.1/Hygro(+)組;C:AngⅡ組;D:pm-ACE2組;E：厄貝沙坦組；F:AngⅡ+pm-ACE2組;G:AngⅡ+厄貝沙坦組;H:pm-ACE2+厄貝沙坦組;I:AngⅡ+pm-ACE2+厄貝沙坦組，下圖同圖3 RT-PCR檢測不同方法干預(yù)VSMC后AT1R mRNA表達情況

圖4 Western印跡法檢測不同方法干預(yù)VSMC后AT1R蛋白表達

3 討 論

ACE2作為該RAS系統(tǒng)的重要成員，主要通過ACE2-Ang(1～7)-Mas受體途徑發(fā)揮與AngⅡ相拮抗的作用，從而調(diào)節(jié)心血管、腎臟功能，降低血壓和心血管事件。動物實驗〔13,14〕發(fā)現(xiàn)，ACE2基因敲除使動物血漿及局部組織AngⅡ水平升高，并易于發(fā)生嚴重心力衰竭。Zhao等〔15〕利用攜帶ACE2基因慢病毒載體感染明顯改善心肌梗死大鼠的心臟重構(gòu)。

目前觀點認為，AngⅡ主要是通過AT1R及其下游信號分子介導(dǎo)VMSC的異常增殖〔2,3〕，AT1R是調(diào)控VMSC增殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實驗的結(jié)果提示ACE2基因轉(zhuǎn)染除了將AngⅡ水解生成Ang-(1～7)以外，可能還通過直接下調(diào)AT1R的表達發(fā)揮抑制VMSC異常增殖的作用。Xiao等〔16〕研究也證明腦部ACE2選擇性高表達在抑制心力衰竭中所致交感神經(jīng)興奮，增強其壓力敏感性的同時也抑制了延髓孤束核和腹外側(cè)核的AT1R蛋白表達。ACE2作為一個羧肽酶，其主要作用是水解AngⅡ生成Ang-(1～7)，那么本研究上述實驗結(jié)果是否由于ACE2基因轉(zhuǎn)染后ACE2活性增加，Ang-(1～7)生成增多，后者進而對AT1R的表達產(chǎn)生抑制作用呢？因為目前關(guān)于Ang-(1～7)與AT1R表達相關(guān)性的研究還比較少，Huang等〔17〕發(fā)現(xiàn)Ang-(1～7)對HSC-T6細胞AT1R的表達并沒有明顯影響，這在一定程度上支持本研究關(guān)于ACE2直接下調(diào)AT1R表達的結(jié)論，后期實驗可通過使用Mas受體拮抗劑A779來阻斷Ang(1～7)作用以進一步確定ACE2對AT1R的直接調(diào)控作用。

不僅如此，本研究發(fā)現(xiàn)ACE2基因轉(zhuǎn)染在調(diào)控AT1R表達方面與AT1R拮抗劑厄貝沙坦有協(xié)同作用，兩者單獨干預(yù)均能下調(diào)AT1R表達，兩者聯(lián)合干預(yù)時對AT1R表達的下調(diào)程度明顯較單獨干預(yù)時強。Igase等〔18〕發(fā)現(xiàn)，奧美沙坦可使大鼠頸動脈球囊損傷后新生內(nèi)膜處ACE2表達明顯增加。有研究發(fā)現(xiàn)〔19〕AngⅡ能夠同過MAPK信號通路抑制ACE2 mRNA表達，ACEI或ARB減少AngⅡ的合成能夠阻止這種負反饋，這可能是ACE2和厄貝沙坦對AT1R具有協(xié)同抑制作用的發(fā)生機制。

雖然本研究尚未明確ACE2與AT1R作用的確切機制，但可以明確ACE2與AT1R存在相互作用，ACE2基因轉(zhuǎn)染及AT1R受體拮抗劑在實驗中均能有效抑制AT1R的表達，并且該作用具有協(xié)同性。

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