衛(wèi) 高 代立娟 宋英杰

(佳木斯大學(xué)研究生部，黑龍江 佳木斯 154007)

呼吸道合胞病毒〔1,2〕感染后，若不及時(shí)處理易并發(fā)呼吸衰竭危及生命。而可選的抗病毒藥物較少，且這些藥物不僅過于廣譜，有的不良反應(yīng)明顯。肉桂醛〔3〕是一種較好的抗病毒中藥，有實(shí)驗(yàn)已證明它在凋亡通路上有較好的抗病毒作用〔4〕，但機(jī)制不清。本實(shí)驗(yàn)從促凋亡蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-9)和抑凋亡蛋白磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)表達(dá)方面探討其原理。

1 材料與方法

1.1材料 呼吸道合胞病毒，Hela細(xì)胞株由佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。肉桂醛、1640培養(yǎng)液、胎牛血清分別購(gòu)買于美國(guó)Sigma 公司、Invitrogen 公司、浙江天杭生物科技股份有限公司。兔抗Caspase-9多克隆抗體北京百奧萊博科技有限公司，p-AKT蛋白多克隆抗體上海鈺博生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 準(zhǔn)備培養(yǎng)箱,其內(nèi)溫度為37℃、CO2濃度為5%。準(zhǔn)備10%的細(xì)胞培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)瓶中；把預(yù)備好的Hela 細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中。將處理好的培養(yǎng)瓶(培養(yǎng)瓶1 d更換1次培養(yǎng)液)放到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)箱中,多次觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)大于80%時(shí)停止,胰酶消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)細(xì)胞到需要量停止。

1.3病毒液制備收集 細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)當(dāng)每日觀察,當(dāng)觀察到細(xì)胞達(dá)70%后，接種準(zhǔn)備好的呼吸道合胞病毒液，后繼續(xù)培養(yǎng),當(dāng)發(fā)生病變到75%時(shí)，經(jīng)過3凍3融(溫度為-80℃，37℃)收集后，收集病毒液置于低溫冰箱保存以備用。

1.4肉桂醛配制 準(zhǔn)備2%細(xì)胞維持液稀釋肉桂醛到需要濃度,準(zhǔn)備濾器將其過濾以備用。

1.5接種病毒毒力測(cè)定 Hela細(xì)胞接種96孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層，將已經(jīng)稀釋好的不同濃度的病毒液置于孔板中，每一個(gè)濃度重復(fù)8孔，后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)陰性對(duì)照組和正常細(xì)胞組，顯微鏡多次觀察細(xì)胞形態(tài)，根據(jù)細(xì)胞變性效果(CPE) 結(jié)果變化用Reed-Muench法計(jì)算細(xì)胞半數(shù)感染量(CCID50)，本實(shí)驗(yàn)中100CCID50/100 μl為病毒攻擊量。直接滅活階段、生物合成階段、病毒吸附階段、藥物預(yù)處理作用，4個(gè)階段均用這個(gè)病毒100CCID50/100 μl呼吸道合胞病毒液。

1.6肉桂醛對(duì)Hela細(xì)胞毒性測(cè)定

1.6.1對(duì)呼吸道合肥病毒的直接滅活作用 將Hela細(xì)胞接種至放有蓋玻片經(jīng)多聚賴氨酸處理的8孔板中，當(dāng)其長(zhǎng)成約70%備用，將低(0.007 810 mg/mg)、中(0.015 63 mg/mg)、高濃度(0.031 25 mg/mg)的肉桂醛與病毒液等量混勻，置37℃溫箱2 h后，將其接種在Hela細(xì)胞已長(zhǎng)成單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃下培養(yǎng)吸附2 h后，棄上清，加維持液，每一濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)病毒組、正常細(xì)胞組作為對(duì)照，置于5%CO2、37℃孵箱培養(yǎng)。每日多次觀察CPE，Western印跡測(cè)定Caspase-9蛋白和p-AKT蛋白表達(dá)情況。

1.6.2對(duì)呼吸道合肥病毒的吸附作用 將Hela細(xì)胞接種至放有蓋玻片經(jīng)多聚賴氨酸處理的8孔板中長(zhǎng)成約70%備用，將低(0.007 810 mg/mg)、中(0.015 63 mg/mg)、高濃度(0.031 25 mg/mg)的肉桂醛與病毒液等量混勻，棄8孔板中培養(yǎng)液。每孔加入不同濃度的肉桂醛與病毒的混合液，設(shè)病毒組、正常細(xì)胞組作為對(duì)照，置37℃溫箱2 h，后棄混合液病毒液，加入2%細(xì)胞維持液，每日多次觀察CPE，Western印跡測(cè)定Caspase-9蛋白和p-AKT蛋白表達(dá)情況,作記錄。

1.6.3生物合成階段 將Hela細(xì)胞接種至放有蓋玻片經(jīng)多聚賴氨酸處理的96孔板中長(zhǎng)成約70%備用，將低(0.007 810 mg/mg )、中(0.015 63 mg/mg)、高濃度(0.031 25 mg/mg)的肉桂醛與病毒液等量混勻，置37℃溫箱2 h。棄8孔板中培養(yǎng)液。每孔加入不同濃度肉桂醛與病毒的混合液，設(shè)病毒組、正常細(xì)胞組作為對(duì)照，置37℃溫箱2 h，棄混合液病毒液，加入細(xì)胞維持液，每日多次觀察CPE，Western印跡測(cè)定Caspase-9蛋白和p-AKT蛋白表達(dá)情況,作記錄。

1.6.4對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用 將Hela細(xì)胞接種至放有蓋玻片經(jīng)多聚賴氨酸處理的96孔板中長(zhǎng)成約70%備用，將低(0.007 810 mg/mg)、中(0.015 63 mg/mg)、高濃度(0.031 25 mg/mg)的肉桂醛與其等量混勻，置37℃溫箱2 h。棄8孔板中培養(yǎng)液。每孔加入不同濃度的肉桂醛與病毒混合液，設(shè)病毒組、正常細(xì)胞組作為對(duì)照置37℃溫箱2 h，棄混合液病毒液。每孔加入病毒液，每日多次觀察CPE，Western印跡測(cè)定Caspase-9蛋白和p-AKT蛋白表達(dá)情況,作記錄。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

肉桂醛在0.078 10～0.031 25 mg/ml之間有效且無毒。一定范圍內(nèi)肉桂醛濃度降低呼吸道合肥病毒毒性。呼吸道合胞病毒毒力在病毒組細(xì)胞病變達(dá)到75%時(shí)，電鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化大于50%即CPE 陽性。用Reed-Muench法計(jì)算得CCID50為106.65，本實(shí)驗(yàn)中100CCID50/100 μl 病毒攻擊量為104.65。與正常細(xì)胞組相比，病毒組Caspase-9蛋白表達(dá)明顯升高、p-AKT蛋白表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)藥物干預(yù)后與病毒組相比，細(xì)胞Caspase-9蛋白表達(dá)明顯下降，且高濃度組下降最多，其次為中濃度，低濃度下降最少(均P<0.01)。細(xì)胞p-AKT蛋白表達(dá)明顯增加，且高濃度組增加最多，其次為中濃度，低濃度增加最少(均P<0.01)。見表1。

表1 Hela細(xì)胞在不同作用方式下Caspase-9、p-AKT蛋白表達(dá)情況

與正常細(xì)胞組比較：1)P<0.01；與病毒組比較：2)P<0.01

3 討 論

細(xì)胞凋亡是當(dāng)代研究的熱點(diǎn)，其途徑眾多〔5～8〕。目前已知外源性通路(死亡受體途徑)，內(nèi)源性通路(線粒體途徑)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路〔9〕三條經(jīng)典的通路，線粒體途徑是其一，而活化的Caspase-9是線粒體途徑中較為上游的分子，它能夠激活其他下游Caspase蛋白(主要為Caspase-3)，引起細(xì)胞凋亡。在經(jīng)典通路之外,還存在其他凋亡相關(guān)的通路p-AKT信號(hào)通路就是其中之一，它能夠抑制凋亡，p-AKT是次通路上游且重要的分子，能夠抑制下游分子,進(jìn)而抑制凋亡向下進(jìn)行。呼吸道合胞病毒感染HeLa細(xì)胞后,能夠引起HeLa細(xì)胞凋亡,但具體機(jī)制不明,本實(shí)驗(yàn)說明肉桂醛的抗呼吸道合肥病毒與凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9和p-AKT表達(dá)有一定關(guān)系，但凋亡通路復(fù)雜，具體促凋亡及抑凋亡機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

1代立娟,韓有文,李紹民,等.肉桂醛對(duì)RSV宿主細(xì)胞Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2014；34(6):1575-7.

2劉 蕾,劉志新,王淑湘,等.翻白草油對(duì)RSV感染宿主HeLa細(xì)胞Fas/FasL蛋白表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2014；9(5):403-7.

3劉愛華,陳洪忠.肉桂揮發(fā)油——β-環(huán)糊精包結(jié)物的研究〔J〕.山東醫(yī)藥工業(yè),1997；(4)：3-4.

4代立娟,王 琳,馮 瀾.肉桂醛抗呼吸道合胞病毒的作用〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2013;33(6):1309-12.

5劉江濤,郭 雄,吳翠艷,等.線粒體細(xì)胞色素c介導(dǎo)的caspase-9激活通路參與大骨節(jié)病關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制〔J〕.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2011;32(5):580-8.

6程新燕,符翠莉.芹菜素對(duì)大鼠骨肉瘤細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白Bax,Bcl-2,Caspase-3,Caspase-9,細(xì)胞色素C的影響〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2016；22(15):139-42.

7張鳳梅,李洪源,李 霞,等.敗醬草多糖體外抗呼吸道合胞病毒作用的研究〔J〕.黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2006；29(1):48-50.

8朱鐵銳,馮海軍,孫 琳.病毒唑霧化吸入治療嬰幼兒呼吸道合胞病毒所致流行性喘憋性肺炎療效觀察〔J〕.黑龍江醫(yī)藥科學(xué),1999;22(4):48.

9趙彥超,顧 耘.細(xì)胞凋亡通路研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代醫(yī)學(xué),2013；41(4):285-8.