劉宏斌 房艷宇 韓 鋼 潘云志 趙吉波 王 澍 張晨昕

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

帕金森病(PD)并非單因素所致，而是多因素交互作用下導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元大量變性、丟失〔1,2〕。然而，神經(jīng)元也表達(dá)多種起著保護(hù)作用的免疫球蛋白〔3,4〕。CD200廣泛表達(dá)于包括神經(jīng)元在內(nèi)的多種細(xì)胞中，研究表明，CD200-CD200R通路是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)下調(diào)神經(jīng)元/小膠質(zhì)細(xì)胞活化的重要機(jī)制〔5,6〕。近年來(lái)與兩者活化可能相關(guān)炎癥通路的研究成為熱點(diǎn)，然而大部分研究均關(guān)于小膠質(zhì)細(xì)胞活化相關(guān)的炎癥通路，而關(guān)于神經(jīng)元變性過(guò)程中相關(guān)炎癥通路的研究較少。本實(shí)驗(yàn)在體外采用PC12細(xì)胞代替神經(jīng)元，探討在神經(jīng)元發(fā)生炎性變性過(guò)程中可能相關(guān)的下游通路。

1 材料及方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 用含10%胎牛血清(FBS)的1640培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó))培養(yǎng)PC12細(xì)胞(上海細(xì)胞庫(kù))2～3 d傳代一次，待細(xì)胞貼壁達(dá)90%時(shí)，取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分組：A：對(duì)照組；B：脂多糖(LPS)處理組；C：CD200抗體(Abcam公司，美國(guó))及LPS(Sigma公司，美國(guó))處理組；D：SB203580及CD200抗體處理組；E：AG490及D200抗體處理組。

1.2免疫熒光檢測(cè)CD200的表達(dá) 96孔板培養(yǎng)PC12細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，5%牛血清白蛋白(BSA)封閉0.5 h，加入1∶1 000稀釋的CD200過(guò)夜，熒光二抗孵育1.5 h，每步驟之間均用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次5 min，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及CD200的表達(dá)。

1.3酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF)-α及白細(xì)胞介素(IL)-6的分泌 以非處理組上清作對(duì)照，設(shè)立復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，按照TNF-α(R&D)及IL-6(R&D)的使用說(shuō)明書(shū),96孔板中分別加入標(biāo)準(zhǔn)樣品及待測(cè)樣本、生物標(biāo)記二抗及酶標(biāo)試劑，37℃，反應(yīng)1 h后洗板5次，加入顯色劑A、B，37℃敷箱中顯色10 min，加終止液，以酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm的光密度值。

1.4Western印跡檢測(cè)P38絲裂原激活蛋白激酶(P38MAPK)、酪氨酸激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子(JAK-STAT3)、pho-P38MAPK及pho-JAK-STAT3的表達(dá) 收集A、B、C組細(xì)胞，提蛋白，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量法用PAGE蛋白上樣緩沖液配制待測(cè)蛋白，上樣電泳，冰上轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉1 h，敷一抗P38MAPK(1∶1 000稀釋,cellsignal)、pho-P38MAPK(1∶1 000稀釋，cellsignal)，pho-JAK-STAT3(1∶1 000稀釋，Abcam)，JAK-STAT3(1∶1 000稀釋，CST)，4℃過(guò)夜，TBST洗膜，二抗孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0及Image J軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1PC12細(xì)胞表面CD200的表達(dá) 熒光顯微鏡觀察PC12細(xì)胞為單層貼壁細(xì)胞，胞體細(xì)長(zhǎng)呈梭形，發(fā)出較多分支，表明CD200可表達(dá)于PC12細(xì)胞表面，見(jiàn)圖1。

圖1 PC12細(xì)胞表面CD200的表達(dá)(×20)

2.2PC12細(xì)胞炎癥因子分泌水平 在不加任何處理因素的情況下TNF-α及IL-6均有基礎(chǔ)分泌分別為〔(277±3.7)、(295±4.7)ng/L〕，單加LPS后細(xì)胞活化，兩者分泌增多〔分別為(324±7.2)、(357±9.2)ng/L〕，而用CD200抗體及LPS處理后較單獨(dú)的LPS處理而言，細(xì)胞活化更加明顯，TNF-α、IL-6分泌繼續(xù)增多〔分別為(398±5.7)、(395±7.7)ng/L〕，各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3PC12細(xì)胞炎癥通路蛋白表達(dá)水平 兩種磷酸化蛋白及半定量分析待測(cè)蛋白與內(nèi)參比而言，C組顯著高于B組及A組，說(shuō)明在CD200抗體及LPS共刺激PC12細(xì)胞后P38MAPK及JAK-STAT3的磷酸化表達(dá)顯著增加，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2，表1。

圖2 各組PC12細(xì)胞炎癥通路蛋白表達(dá)

表1 各組炎癥通路蛋白表達(dá)水平比較

與A組比較：1)P<0.05；與B組比較：2)P<0.05

2.4兩條通路阻斷劑對(duì)炎癥因子水平的影響 與C組TNF-α、IL-6水平〔(384±5.2)、(396±4.8)ng/L〕比較，D組〔(341±4.5)、(353±4.2)ng/L〕和E組〔(375±2.7)、(378±2.9)ng/L〕明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。加入足量的兩條通路阻斷劑后，TNF-α、IL-6分泌均有所減低，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明pho-P38MAPK及pho-JAK-STAT3通路均參與了CD200抗體及LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞的激活。

3 討 論

PD是常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，在我國(guó)，65歲以上的人群總體患病率為1 700/10萬(wàn)，與歐美國(guó)家相似，其發(fā)病率隨著年齡的增高而升高，男性高于女性〔7～9〕。病理及尸檢結(jié)果表明，黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元大量變性丟失，神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的炎性反應(yīng)參與了PD的發(fā)生及進(jìn)展〔10,11〕，CD200廣泛表達(dá)在神經(jīng)元、B細(xì)胞等細(xì)胞表面，而其受體CD200R則局限表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞等髓樣細(xì)胞表面，兩者其一發(fā)生改變均可導(dǎo)致神經(jīng)元及小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)PC12細(xì)胞存在CD200的表達(dá)。眾所周知，神經(jīng)炎癥在神經(jīng)變性疾病中發(fā)揮重要作用〔12〕，探討一種維持CD200/CD200R通路的平衡進(jìn)而維持神經(jīng)元及小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)的治療手段，必然會(huì)成為未來(lái)治療與神經(jīng)炎癥有關(guān)的神經(jīng)變性性疾病的新方向。

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