李天梁 徐 亮 李蜀華 冷 尉

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，四川 瀘州 646000)

轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1是一類多功能細(xì)胞因子，參與了細(xì)胞分化、增殖、凋亡等生理過程，TGF-β1在多種病理過程中都大量表達(dá)，如慢性炎癥疾病〔1〕和癌癥〔2〕等。大量研究證實，在腫瘤微環(huán)境中，TGF-β1能夠促進血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、增加蛋白水解酶合成等〔3～5〕。此外，TGF-β1還能夠促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，EMT是促進腫瘤惡性進展的主要機制之一。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的典型特點是其上皮標(biāo)志蛋白鈣黏附蛋白E(E-cadherin)的表達(dá)降低和間質(zhì)標(biāo)志蛋白波形蛋白(Vimentin)表達(dá)增加。Kruppel樣因子(KLF)8屬于Kruppel樣C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，多種KLF家族成員被證實在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著癌基因或者抑癌基因的功能，如KLF4、KLF5和KLF6。近來研究表明，KLF8在胃癌細(xì)胞中過量表達(dá)，并且在調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲中發(fā)揮著重要作用〔3〕，但是具體的機制并不清楚。已有研究證實KLF8與EMT之間存在聯(lián)系〔4〕，并且KLF8是TGF-β1的下游轉(zhuǎn)錄因子之一，參與腫瘤的形成、進展和EMT等過程〔5〕。然而，關(guān)于KLF8在胃癌中的研究相對較少。本研究旨在探討TGF-β1是否能夠促進胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT，并且KLF8是否參與了TGF-β1介導(dǎo)的EMT，從而促進細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株SGC7901和MKN45(中國上海科學(xué)院細(xì)胞庫)，培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中(含10% 胎牛血清，10×104U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素)，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。TGF-β1處理組，即10 ng/ml TGF-β1，預(yù)處理胃癌細(xì)胞24 h，再進行后續(xù)實驗。

1.2脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染KLF8 siRNA 取4×105個處于對數(shù)生長期的MKN45細(xì)胞，接種于3.5 cm培養(yǎng)皿中，24 h后，采用脂質(zhì)體Lipofectamine?3000(美國Invitrogen公司)將siKLF8(5′-CCGGCCCAGCACTGTTTAATGACATCTCGAGATGTCATTAAACAGTGCTGGGTTTTTG-3′)及siRNA無關(guān)序列(陰性對照組)(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)轉(zhuǎn)染至MKN45細(xì)胞中，操作步驟參照試劑說明書。實驗分為空白對照(NC)組，siKLF8干擾組及陰性對照組

1.3熒光實時定量PCR(qRT-PCR) 收集各試驗組細(xì)胞約1×105個，各細(xì)胞樣品中加入1.0 ml Trizol(美國Thermo公司)，抽提細(xì)胞總RNA，按照RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)的說明書操作。紫外分光光度計(美國Thermo公司)檢測總RNA濃度及純度(A260/A280)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)進行逆轉(zhuǎn)錄。KLF8、E-cadherin、Vimentin及內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的qRT-PCR引物序列(上海生工生物工程股份有限公司)：KLF8正向5′-3′CTGCCTAATCTACCCAATCAGTTCA，反向5′-3′CTGGACAGTTGCTTATGGCATC；E-cadherin正向5′-3′GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA，反向5′-3′AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC；Vimentin正向5′-3′CACCTCTAAGGCCATCACCAGCTAACCAACGA，反向5′-3′TCAAGGTCAAGACGTGCCAGA；GAPDH正向5′-3′TGGTGAAGACGCCAGTGGA，反向5′-3′CTGAGAACGCACCGTCAAGG。定量PCR擴增儀(ABI 7500，美國ABI公司)檢測KLF8、E-cadherin、Vimentin表達(dá)水平。qRT-PCR擴增體系為10 μl，反應(yīng)條件：50℃，2 min；95℃，10 min；95℃，15 s；60℃，1 min，進行35個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法表示各基因mRNA相對表達(dá)量，重復(fù)3次獨立實驗后進行統(tǒng)計分析。

1.4Western印跡試驗 收集各試驗組細(xì)胞(2～5)×105個，加入RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，抽提細(xì)胞全蛋白，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(美國Thermo公司)檢測蛋白濃度。10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉室溫振蕩封閉1 h，Tris鹽酸緩沖液(TBS-T)洗膜，鼠抗人KLF8單克隆抗體(sc-134375，美國Santa公司，1∶1 000稀釋)，鼠抗人E-cadherin單克隆抗體(ab1416，美國Abcam公司，1∶1 000稀釋)，鼠抗人Vimentin單克隆抗體(ab8978，美國Abcam公司，1∶1 000稀釋)，兔抗人GAPDH單克隆抗體(sc-367714，美國Santa公司，1∶2 000稀釋)，4℃孵育過夜。TBS-T洗膜后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠二抗(上海英基生物科技有限公司，1∶10 000稀釋)，室溫孵育1 h，加電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光液(美國Millipore公司)進行化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像儀(GelDoc-It，美國UVP公司)對蛋白條帶進行觀察，獲取圖像，并對圖像進行灰度分析(Image Lab軟件)，記錄灰度值，計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值。重復(fù)3次獨立試驗后，進行統(tǒng)計分析。

1.5細(xì)胞劃痕試驗 取對數(shù)生長期細(xì)胞(5～7)×105個，接種于6孔板中，24 h后，細(xì)胞匯合度達(dá)90%以上；使用移液器槍頭，垂直于6孔板底部，均勻劃線，每孔3條平行線；磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，去除漂浮的細(xì)胞，加入無血清RPMI1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，分別于0、24 h后顯微鏡(BX61，日本Olympus公司)下拍照，并計算細(xì)胞間距離。細(xì)胞間距離越大，說明遷移能力越低，重復(fù)3次獨立試驗后，進行統(tǒng)計分析。

1.6細(xì)胞侵襲試驗 24孔板中放置Transwell小室，在小室上層加入4.0 μg/μl Matrigel基質(zhì)膠50 μl，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，使Matrigel基質(zhì)膠凝固；在24孔板下室中加入500 μl的含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)液，Transwell小室中加入100 μl的各試驗組MKN45細(xì)胞懸液(細(xì)胞總數(shù)約1×105個)；48 h后，去除24孔板下室中的培養(yǎng)液，棉簽擦去Transwell小室內(nèi)室膜上的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫溶液染色，室溫5 min，顯微鏡(BX61，日本Olympus公司)下觀察，每孔隨機選取3個視野拍照，并記錄每個視野的細(xì)胞數(shù)目。重復(fù)3次獨立試驗后，進行統(tǒng)計分析。

1.7高內(nèi)涵細(xì)胞分析試驗 處于對數(shù)生長期的MKN45細(xì)胞，接種于96孔板中，每孔5 000個細(xì)胞；24 h后棄去舊培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，Heochst 33342對細(xì)胞進行熒光染色，15 min，預(yù)冷PBS洗滌2次，根據(jù)試驗分組，對細(xì)胞進行不同處理后，采用高內(nèi)涵藥物篩選平臺(Cellomics Array Scan VTI 1700 plus，美國Thermo公司)檢測細(xì)胞72 h內(nèi)的運動能力。重復(fù)3次獨立試驗后，進行統(tǒng)計分析。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件，計量資料采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1TGF-β1促進胃癌細(xì)胞EMT Western印跡試驗結(jié)果顯示，在胃癌細(xì)胞SGC7901和MKN45中，與NC組〔E-cadherin:(1.00±0.01),(1.20±0.02);Uimentin:(0.99±0.03),(0.71±0.03)〕細(xì)胞相比，TGF-β1處理組細(xì)胞內(nèi)的E-cadherin表達(dá)量(0.25±0.02，0.21±0.02)顯著降低(t=44.126，52.679；均P=0.000)，而Vimentin的表達(dá)量(4.24±0.11，3.86±0.05)則顯著增加(t=48.668，83.527；均P=0.000)，見圖1A。本研究中，選擇MKN45細(xì)胞進行后續(xù)試驗。qRT-PCR結(jié)果顯示，TGF-β1處理組MKN45細(xì)胞中，E-cadherin mRNA表達(dá)水平(0.22±0.01)顯著低于NC組(1.01±0.01)，Vimentin mRNA表達(dá)水平(2.91±0.05)顯著高于NC對照組(0.99±0.03)(t=73.314，50.325；均P=0.000)。經(jīng)TGF-β1處理后，MKN45細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了顯著變化，見圖1B。以上實驗結(jié)果表明，TGF-β1能有效地減少上皮標(biāo)志蛋白的表達(dá)，促進間質(zhì)標(biāo)志蛋白的表達(dá)，從而促進胃癌細(xì)胞EMT。

圖1 胃癌細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin的表達(dá)

2.2TGF-β1誘導(dǎo)KLF8表達(dá) qRT-PCR和WB試驗結(jié)果顯示，與NC組(1.01±0.03，1.00±0.02)相比，TGF-β1處理組MKN45細(xì)胞內(nèi)KLF8 mRNA(2.14±0.15)和蛋白(2.43±0.07)表達(dá)水平分別增加了2.1倍和2.4倍。以上試驗結(jié)果表明，在胃癌細(xì)胞中，TGF-β1能夠誘導(dǎo)KLF8的表達(dá)。

2.3TGF-β1通過KLF8信號通路調(diào)節(jié)E-cadherin和Vimentin表達(dá) 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siKLF8，可降低MKN45細(xì)胞內(nèi)KLF8的表達(dá)水平(NC組：1.02±0.02，陰性對照組：0.95±0.11，siKLF8干擾組：0.29±0.02；t=39.154，9.638，均P=0.000)。見圖2A。在此基礎(chǔ)上，檢測siKLF8處理組MKN45細(xì)胞內(nèi)的E-cadherin和Vimentin表達(dá)量，結(jié)果顯示，siKLF8能夠部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1的功能，導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)上升，Vimentin表達(dá)下降，見圖2B，表1。以上試驗結(jié)果表明，TGF-β1能夠通過KLF8信號通路調(diào)節(jié)E-cadherin和Vimentin表達(dá)。

(1)MKN45；(2)MKN45+TGF-β1;(3)NC;(4)NC+TGF-β1;(5)siKLF8;(6)siKLF8+TGF-β1圖2 TGF-β1對各試驗組MKN45細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin表達(dá)的影響

表1 siKLF8對TGF-β1功能的逆轉(zhuǎn)作用

2.4siKLF8逆轉(zhuǎn)TGF-β1介導(dǎo)的促遷移和侵襲能力 細(xì)胞劃痕試驗顯示，siKLF8處理組MKN45細(xì)胞的遷移能力比NC組和siKLF8陰性對照組明顯降低，且TGF-β1處理后，能夠顯著促進NC組和siKLF8陰性對照組MKN45細(xì)胞的遷移能力，然而，TGF-β1(10 ng/ml，預(yù)處理24 h)對siKLF8處理組MKN45細(xì)胞的遷移能力，則無明顯影響(P>0.05)。見圖3A，表2。

Transwell侵襲試驗結(jié)果顯示，與NC組和siKLF8陰性對照組相比，siKLF8處理組MKN45細(xì)胞的侵襲能力顯著降低；TGF-β1能夠顯著提高NC組和siKLF8陰性對照組的侵襲能力，但是TGF-β1對siKLF8處理組MKN45細(xì)胞的侵襲能力則無明顯影響(P>0.05)。見圖3B，表2。以上試驗結(jié)果表明，KLF8在TGF-β1介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中，發(fā)揮重要作用。

圖3 siKLF8對TGF-β1誘導(dǎo)的遷移和侵襲能力的影響

表2 siKLF8對TGF-β1誘導(dǎo)的遷移、侵襲能力的影響

2.5TGF-β1通過KLF8促進細(xì)胞的運動能力 高內(nèi)涵細(xì)胞分析試驗結(jié)果顯示，48 h及72 h時，siKLF8處理組MKN45細(xì)胞的運動速度比NC組和siKLF8陰性對照組明顯下降；TGF-β1處理后，能夠顯著增加NC組和siKLF8陰性對照組運動速度，然而，TGF-β1對siKLF8處理組MKN45細(xì)胞的運動速度則無明顯影響(P>0.05)。見表3。

表3 各試驗組MKN45細(xì)胞的相對運動速度

與對應(yīng)組的NC組和siKLF8陰性對照組比較：1)P<0.05；與對應(yīng)的TGF-β1未處理組相比：2)P<0.05

3 討 論

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，具有高侵襲性，易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點，這也是導(dǎo)致胃癌患者治療失敗，不良預(yù)后甚至死亡的重要原因〔6，7〕。因此，尋找與腫瘤遷移侵襲相關(guān)的靶蛋白，闡明他們促進遷移侵襲的機制，是臨床亟待解決的問題之一。胃癌細(xì)胞起源于腺上皮，具有上皮細(xì)胞的特征，但在某些因素的誘導(dǎo)下，胃癌細(xì)胞的上皮源性標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下降，而間質(zhì)性標(biāo)志物Vimentin表達(dá)增加，使細(xì)胞從上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，即EMT〔8〕。研究證實，EMT能夠促進腫瘤細(xì)胞的惡性進展〔9，10〕。TGF-β生長因子主要包括TGF-β1，TGF-2和TGF-β3，而TGF-β1在胃癌EMT過程中研究最為廣泛，TGF-β1除了參與調(diào)控細(xì)胞增殖和免疫應(yīng)答以外，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中也發(fā)揮著雙重作用，既能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期，發(fā)揮抑制腫瘤的作用，又能夠促進腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移〔11，12〕。近年來的研究證實，KLF8是TGF-β1的下游因子，并且參與了細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，在腫瘤的形成和惡性進展中發(fā)揮著重要的作用。在多種腫瘤細(xì)胞中存在著KLF8的異常表達(dá)，如膀胱癌〔13〕、胰腺癌〔14〕、乳腺癌〔15，16〕等。

本研究表明TGF-β1刺激后，胃癌細(xì)胞中上皮標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平下降，而間質(zhì)標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平增加，進而促進了胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT。本研究也提示KLF8在TGF-β1誘導(dǎo)的一系列細(xì)胞變化中可能發(fā)揮作用。采用siKLF8干擾MKN45細(xì)胞內(nèi)KLF8的表達(dá)后，能夠部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1介導(dǎo)的降低E-cadherin、增加Vimentin表達(dá)，促進EMT的功能。本研究結(jié)果表明，TGF-β1能夠增加細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而在siKLF8組MKN45細(xì)胞中，TGF-β1并不能夠促進細(xì)胞遷移和侵襲，即在胃癌細(xì)胞中，KLF8作為TGF-β1下游的效應(yīng)分子，參與了TGF-β1介導(dǎo)的增強細(xì)胞遷移和侵襲的過程。

綜上所述，TGF-β1能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT，并且TGF-β1能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)KLF8的表達(dá)；在胃癌細(xì)胞中，TGF-β1/KLF8信號通路激活后，細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增強；KLF8作為TGF-β1誘導(dǎo)EMT過程中的關(guān)鍵下游效應(yīng)分子，在胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲中發(fā)揮著極其重要的作用，TGF-β1/KLF8信號通路有可能作為逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞EMT的作用靶標(biāo)。

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