仇志學(xué) 單中書 李國棟 劉立民

(青海省人民醫(yī)院骨科，青海 西寧 810007)

骨缺損主要病因有創(chuàng)傷、感染、腫瘤及各種先天性疾病等。骨缺損較小時(shí)一般可自行愈合，但當(dāng)骨缺損較大時(shí)則需要手術(shù)治療〔1～3〕。組織工程骨技術(shù)即利用組織工程手段，使得缺損部位具有成骨能力的細(xì)胞進(jìn)行生長，引導(dǎo)骨組織再生，構(gòu)建培育新生骨組織以填補(bǔ)骨缺損實(shí)現(xiàn)骨性愈合與良好修復(fù)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2是誘導(dǎo)骨細(xì)胞生成的重要因子〔4,5〕。但是由于BMP-2含量甚微，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，所以無法大量提純，另外，BMP-2僅能作為一種誘導(dǎo)刺激物，使未分化間充質(zhì)細(xì)胞向骨系細(xì)胞轉(zhuǎn)化成骨，卻無支架和充填缺損作用，因而使其臨床應(yīng)用受到限制。羥基磷灰石(HAP)是一種磷酸鈣類天然骨礦，相容性良好，是骨組織的主要成分，但其脆性較大，不利于骨缺損修復(fù)，為此可摻雜其他天然衍生物或高分子成分以提高其強(qiáng)度。研究者〔6〕通過鈦摻雜合成了具有良好燒結(jié)穩(wěn)定性的HAP納米粉，鈦摻雜對(duì)HAP的燒結(jié)穩(wěn)定性、晶粒尺寸和形貌有顯著影響。有研究〔7〕采用鈦摻雜HAP/氧化鋯復(fù)合材料，抑制了HAP與氧化鋯之間的熱反應(yīng)，把鈦離子摻入HAP的晶格，使其表現(xiàn)出良好的相穩(wěn)定性。而硅(Si)是人體骨骼必需的材料，在早期可促進(jìn)骨的礦化，能有效促進(jìn)骨的修復(fù)。近年來采用凍干法制備含Si的HAP支架得到臨床的廣泛重視。本研究采用Si代HAP(Si-HAP)負(fù)載BMP-2活性多肽P28修復(fù)大鼠顱骨缺損，探究其有效性。

1 資料與方法

1.1合成P28 P28從BMP-2的肽73～92關(guān)節(jié)位表中提取后利用FMOC/TBU固相肽合成法合成，并將初始合成得到粗肽多次通過凝膠過濾層析得到進(jìn)一步純化，最后高效液相色譜法(HPLC)測定P28 純度≈96.8%。

1.2制備及觀察Si-HAP 共同沉淀法合成法：先將270 ml硝酸鈣與正硅酸乙烯溶液相混合而成，后再將300 ml 0.06 mol/L(NH4)H2PO4溶液加入到混合物中。鈣與磷的比例保持在1∶1.65，且Si與鈣的比例會(huì)因加入不同正硅酸乙烯在1%～10%間變化。所有的反應(yīng)需保持溫度在80℃且pH值在9～10之間可用的銨溶液。3 h后，所有已獲得的沉淀通過過濾和蒸餾水的洗滌從這些溶液中分離。然后將Si-HAP納米粒子放在80℃的烤箱中過夜以干燥。使用電子掃描顯微(SEM) 觀察Si-HAP形態(tài)，為了使得制備得到Si-HAP具有更好的導(dǎo)電性，所有的樣品都用10 nm厚的Au薄膜覆蓋后使用掃描電子顯微鏡來檢查涂層的形態(tài)，鋅與鈣的比例使用能量色散光譜儀來測定。

1.3制備復(fù)合材料 分別將100 mg HAP和Si-HAP預(yù)濕后加入純乙醇放入攪拌機(jī)內(nèi)輕攪200 r/min×2 h，然后使用軌道振動(dòng)篩使其和10 mg P28復(fù)合，靜置合成后的物料，待其干燥前用去離子水清除乙醇。所有材料完全去除乙醇后于-20℃下冷存?zhèn)溆谩?/p>

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取6～8 w SD雄性大鼠30只(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證編號(hào)HB20140014)，體重200～250 g，二級(jí)清潔，健康，飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境下。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為A、B、C組各10只，A組為空白對(duì)照組、B組HAP+P28修復(fù)、C組Si-HAP+P28修復(fù)。

1.5外科處理 B組、C組采用10%水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，手術(shù)區(qū)被毛，消毒鋪巾，于大鼠顱骨正中縱向行1.5 cm切口，暴露顱骨，鉆孔形成一直徑5 mm的圓形缺損，將HAP+P28植入B組缺損處和將Si-HAP+P28植入C組缺損處，A組不做處理。用生理鹽水沖洗后逐層縫合傷口。分別觀察記錄3組術(shù)后第6、12周的一般情況、影像學(xué)檢查及組織學(xué)檢查結(jié)果。

1.6CT圖像評(píng)價(jià) 術(shù)后6～12 w，每組取5只大鼠注射過量戊巴比妥鈉處死后將顱骨摘除，使用三維CT重建術(shù)掃描大鼠顱骨觀察是否形成新骨，儀器采用德國西門子SOMATOM sensation 64排螺旋CT，通過圖像輔助處理軟件對(duì)CT圖像進(jìn)行顱骨缺損修復(fù)比例的判斷。

1.7解剖組織學(xué)觀察 將獲取顱骨浸泡于10%甲醛溶液中，加入10%乙二胺四乙酸(EDTA)并調(diào)整pH值為7.0，于4℃下保存3 w進(jìn)行完全脫鈣，取出脫水和后，石蠟包裹顱骨，使用自動(dòng)切片機(jī)取厚度約5 mm切片，后使用蘇木素-伊紅(HE)染色后使用光學(xué)顯微鏡觀察并拍片，使用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測量片內(nèi)骨形成量。圖像系統(tǒng)為HPIAS21000 高清晰度圖像處理系統(tǒng)，購自武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1一般情況比較 實(shí)驗(yàn)前各組周齡和體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。大鼠經(jīng)手術(shù)后，生命體征均正常，沒有發(fā)生實(shí)驗(yàn)過程中死亡。植入部位沒有發(fā)生感染，無化膿、潰破等情況。

2.2影像學(xué)指標(biāo)比較 術(shù)后6 w，A組CT影像顯示缺損處新骨生成情況較差，修復(fù)比例為12.7%，B組顱骨缺損處新骨生成情況明顯，修復(fù)比例為66.5%，C組缺損處基本被新骨覆蓋，修復(fù)比例為95.8%，3組組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；12 w后，A組修復(fù)比例為37.2%，B組97.8%，C組100%，B組和C組修復(fù)效果相似，顯著優(yōu)于A組(P<0.05)，見圖1。

2.3組織學(xué)觀察比較 術(shù)后6 w，C組顱骨缺損處生成大量的成纖維細(xì)胞和肉芽組織，軟組織恢復(fù)情況良好。B組存在生物材料退化和分散的骨樣組織。而A組則更為明顯，軟組織壞死面積較大呈現(xiàn)黑色；術(shù)后12 w，C組顱骨骨小梁形成緊湊骨組織，且肉芽組織轉(zhuǎn)化為纖維組織將修復(fù)植入物完全包裹，缺損處肌肉組織和正常肌肉組織同樣平滑細(xì)膩。B組顱骨恢復(fù)僅剩下帶狀缺損及軟組織壞死，恢復(fù)效果較好。A組仍殘留較大壞死軟組織，缺損處無明顯骨形成，見圖2。

圖1 3組6、12 w顱骨缺損修復(fù)CT掃描圖

圖2 3組術(shù)后6、12 w缺損處形態(tài)學(xué)(HE，×400)

3 討 論

近年來，骨缺損的修復(fù)逐漸成為骨組織工程領(lǐng)域的熱點(diǎn)〔8〕。自體骨由于一方面具有天然骨的正常生理結(jié)構(gòu)，另一方面含有促進(jìn)骨組織修復(fù)再生的細(xì)胞與生長因子，因而被認(rèn)為是進(jìn)行骨缺損修復(fù)最理想的材料〔9〕。但由于存在自體骨與缺損骨形態(tài)不一致、取骨量受到限制及骨吸收過程的不確定性等原因，使其尚未能廣泛應(yīng)用于臨床〔4〕。而組織工程骨則可突破上述限制，通過人體組織工程制備出具有良好的骨誘導(dǎo)活性、骨傳導(dǎo)性、骨降解性及免疫排斥性較低的人工骨材料〔2〕。

在骨組織工程中，BMP、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等均具有誘導(dǎo)骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞生成的作用，由于BMPs是骨形成過程中的三種促進(jìn)因子之一，它們?cè)谏矬w的生長過程中起著重要的調(diào)控作用。BMP-2的骨誘導(dǎo)活性最強(qiáng)〔10〕。BMP-2是一種多功能生長因子，屬于轉(zhuǎn)化生長因子超家族成員，是最重要的骨形成調(diào)控因子〔11〕。BMP-2可通過刺激骨髓基質(zhì)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)其黏附、體外增殖及定向分化為成骨前體細(xì)胞，形成軟骨內(nèi)成骨，從而誘導(dǎo)新生骨組織形成〔12〕。但是BMP-2在體內(nèi)半衰期一般小于16 min，降解速度極快〔13〕。則臨床應(yīng)用中需選擇性能優(yōu)良的緩釋載體負(fù)載BMP-2，使BMP-2在體內(nèi)緩慢釋放，從而能長時(shí)間發(fā)揮骨缺損的修復(fù)作用，提高機(jī)體對(duì)BMP-2的利用率〔14〕。性能優(yōu)良的緩釋載體不僅需要具備強(qiáng)大的緩釋能力，還需要具有誘導(dǎo)成骨細(xì)胞黏附增值的能力〔15〕，單一的生物材料難以滿足上述條件，為此復(fù)合材料成為骨組織工程技術(shù)優(yōu)先考慮的材料。

研究顯示，HAP是天然骨組織礦物質(zhì)成分，具有較高的組織相容性，對(duì)某些化學(xué)分子及蛋白質(zhì)具有較高親和力，具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)骨生成的能力〔16〕。但由于HAP與骨組織的整合速率及反應(yīng)性較低，從而延長了骨缺損修復(fù)時(shí)間〔17〕。為了優(yōu)化HAP的臨床性能，研究人員發(fā)現(xiàn)在HAP中摻雜某些微量元素，如Si〔18〕。Si離子的摻入可改變HAP的表面晶型，增強(qiáng)HAP的骨活性，可顯著提高HAP誘導(dǎo)骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞增殖生成的能力和速度，并且可提升骨組織的抗菌能力〔19〕。研究〔20〕表明，與適宜的載體復(fù)合來修復(fù)骨缺損比單用BMPs或單用其載體本身誘導(dǎo)成骨的效果更好。該生長因子能誘導(dǎo)植入?yún)^(qū)周圍未分化的間充質(zhì)細(xì)胞形成軟骨和新生骨，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟，參與骨和軟骨生長發(fā)育及其重建過程，進(jìn)而加速骨缺損修復(fù)。通過該工藝控制制備出的P28經(jīng)過發(fā)酵、分離、純化后得到的樣品可保持很高的純度，消除了潛在的病源傳播危險(xiǎn)，展示出美好的應(yīng)用前景。在人重組BMP-2化學(xué)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上自行設(shè)計(jì)合成的相關(guān)活性多肽P28能夠發(fā)揮與其相同的特異性與骨結(jié)合促進(jìn)成骨的作用。研究發(fā)現(xiàn)〔20〕，P28的生物效應(yīng)是通過其分子的抗原決定族與細(xì)胞膜上的受體形成異聚復(fù)合物來實(shí)現(xiàn)的，而P28短鏈多肽可以通過多肽合成儀大規(guī)模制備，降低了成本，提高材料的安全性。同時(shí)，短鏈多肽上與細(xì)胞表面受體結(jié)合的活性位點(diǎn)能夠充分暴露，具有更強(qiáng)的生物活性，其可以增強(qiáng)材料的骨誘導(dǎo)性和生物相容性，為P28活性多肽復(fù)合物的開發(fā)及應(yīng)用創(chuàng)造了條件。有學(xué)者〔21〕證實(shí)了P28活性多肽具有體外定向誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)向成骨方向定向分化的作用，且這種誘導(dǎo)作用具有劑量依賴性，高分子聚合材料復(fù)合該多肽后具有骨誘導(dǎo)活性，增強(qiáng)成骨能力。

Si的加入的確可以改變復(fù)合材料的臨床性能。可能與Si的強(qiáng)化作用大大提高了力學(xué)性能、顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化有關(guān)〔19〕。P28可促進(jìn)骨骼生產(chǎn)及生長原因可能包括如下：①P28中包含有BMP序列內(nèi)能夠誘導(dǎo)成骨分化關(guān)鍵基因片段，能夠促使骨骼祖細(xì)胞分化；2P28分子量更小，且由于是人工合成，其機(jī)構(gòu)更加穩(wěn)定，有效克服BMP-2因其復(fù)雜結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致部分活性位點(diǎn)難以暴露的劣勢；③P28氨基酸序列內(nèi)含有多種脯氨酸，且其是生物體皮膚、牙齒、骨骼、關(guān)節(jié)內(nèi)膠原蛋白的重要組成部分。本研究顯示p28結(jié)合Si-HAP細(xì)胞信號(hào)可明顯加快顱骨成骨能力。

綜上所述，摻雜Si的HAP負(fù)載BMP-2活性多肽修復(fù)材料是一種理想的生物支架、緩釋載體和修復(fù)材料〔22〕。但本研究尚為小樣本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果外推到人體尚存在一定的不確定性，并且對(duì)于Si是如何提高HAP性能等機(jī)制尚未闡明。

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