周忠志 黃新靈 楊雙喜 蘭宏偉

(湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院燒傷整形科，湖南 長沙 410007)

皮膚基底細胞癌(BCC)是常見的皮膚惡性腫瘤之一，占所有皮膚惡性腫瘤的65%～75%，早期表現(xiàn)為細小的半透明樣局部隆起病變，后期癥狀多樣化，容易漏診和誤診〔1，2〕。BCC腫瘤細胞侵襲能力強，嚴重破壞深部組織〔3〕?；|金屬蛋白酶(MMP)-13參與降解細胞外基質和多種腫瘤細胞的遷移、侵襲等過程〔4〕。MMP-13在非小細胞肺癌〔4〕、乳腺癌〔5〕、肝癌〔6〕等多種腫瘤組織中表達量升高，提示MMP-13升高與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要聯(lián)系。本研究探討RNA干擾抑制MMP-13的表達對BCC癌細胞侵襲、遷移能力的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人BCC A431細胞系由湖南中醫(yī)藥大學實驗室保存，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、Lipofectamine2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司，Transwell試劑盒購自BD Bioscience公司，蛋白提取試劑盒購自上海碧云天公司，MMP-13抗體購自Calbiochem公司，上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體、細胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體、β-鏈蛋白(catenin)抗體、β-actin等抗體、羊抗鼠二抗購自美國abcam公司。

1.2細胞培養(yǎng) A431細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2，每天觀察細胞生長狀態(tài)，0.25%胰酶消化收集細胞進行傳代，及時更換新鮮培養(yǎng)基，生長狀態(tài)良好的對數(shù)期細胞用于后期實驗。

1.3細胞轉染 取對數(shù)期細胞，胰酶消化成單細胞懸液，以1×106/孔接種至6孔板中，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，與轉染前1 h更換為不含抗生素的新鮮培養(yǎng)基。待細胞融合度約為80%時按照轉染試劑說明書進行轉染，轉染后每天觀察細胞狀態(tài)。實驗分為3組，對照組：不做任何處理的細胞，加入等量的Lipofectamine2000；MMP-13組：加入Lipofectamine2000和pLightSwith-MMP13-NC；MMP13-siRNA組：Lipofectamine2000和pLightSwith-MMP13-siRNA。各組細胞置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后更換含10%胎牛血清和青霉素、鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，Western印跡檢測轉染效果。

1.4Transwell實驗檢測細胞的侵襲、遷移能力 實驗前將提前配置好的Matrigel膠包被在Transwell小室基底膜上室，置于24孔板上，37℃孵育2 h。將轉染后48 h的各組細胞用不含血清的培養(yǎng)基重懸，以1×103/孔接種于小室上室，下室中加入600 μl 10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，待細胞侵襲24 h后，取出小室，棄去培養(yǎng)液，95%乙醇固定15 min，5%結晶紫染色15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，用棉簽輕輕拭去Matrigel膠和上室中未穿出的細胞，在倒置顯微鏡下取上、下、左、右、中5個視野計數(shù)，取平均數(shù)表示細胞侵襲、遷移力，每組3個復孔。遷移實驗上室不包被Matrigel膠，其余步驟與侵襲實驗相同。

1.5Western印跡檢測轉染細胞中β-catenin、CyclinD1、E-cadherin蛋白表達量 取各組轉染后48 h的細胞，PBS洗滌，加入RIPA裂解液，10 000 r/min，4℃離心10 min，保留上清液，利用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白的濃度，取30 μg蛋白煮沸變性5 min，使用8%～15%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠進行電泳，待溴酚藍到達膠的底部，終止電泳。將凝膠轉入聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，Tris緩沖鹽水-吐溫(TBST)緩沖液清洗后，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入牛奶封閉液稀釋的一抗，室溫下孵育2 h，TBST清洗3次，每次10 min，加入二抗，室溫避光孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min。通過電化學發(fā)光(ECL)蛋白印跡檢測系統(tǒng)進行檢測，以目的條帶灰度值與內參β-actin灰度值的比值為各目的蛋白的相對表達量。

1.6統(tǒng)計學方法 使用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1各組MMP-13蛋白表達量、細胞遷移、侵襲數(shù)比較 與對照組比較，MMP-13組MMP-13蛋白表達量、細胞遷移、侵襲數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；MMP-13-siRNA組MMP-13蛋白表達量、細胞遷移、侵襲數(shù)均顯著低于對照組及MMP-13組(均P<0.05)。見圖1、表1。

2.2各組β-catenin、CyclinD1、E-cadherin蛋白表達量比較 與對照組相比，MMP-13組β-catenin、CyclinD1、E-cadherin蛋白表達量差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；MMP-13-siRNA組β-catenin、CyclinD1蛋白表達量顯著低于對照組及MMP-13組(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達量顯著高于對照組及MMP-13組(P<0.05)。見表2、圖2。

圖1 各組MMP-13的表達量

表1 各組MMP-13蛋白表達量、細胞遷移、侵襲數(shù)比較

與MMP-13-siRNA組比較：1)P<0.05；下表同

圖2 各組β-catenin、CyclinD1、E-cadherin蛋白表達情況

表2 各組β-catenin、CyclinD1、E-cadherin蛋白表達量比較

3 討 論

BCC常發(fā)生于面部、頸部、四肢的皮膚表層或附屬器，少見于軀干。研究認為，BCC由太陽輻射、電離輻射、放療、局部慢性炎癥等高危因素引起〔7〕，但發(fā)生發(fā)展機制尚不清楚，治療目前多采用手術切除、放療、局部用藥或光動力療法，但手術和放療治療復發(fā)率較高〔8〕。腫瘤惡化和復發(fā)多是因為局部腫瘤細胞發(fā)生浸潤和遠端轉移。MMPs在降解細胞外基質和血管基底膜的過程中發(fā)揮重要作用，同時調節(jié)多種腫瘤細胞侵襲、遷移過程〔9〕。研究證明，S100A4可通過調節(jié)下游信號通路的靶基因MMPs增強腫瘤細胞侵襲、遷移能力〔10～12〕。MMP-13屬于MMPs家族成員之一，對腫瘤細胞的轉移浸潤過程起重要調節(jié)作用。研究結果顯示，MMP-13的表達量下降可抑制腫瘤細胞侵襲、轉移〔13,14〕。為闡明MMP-13對皮膚基底細胞癌細胞侵襲、遷移的影響，本研究結果提示MMP-13參與了基底細胞癌細胞的侵襲、遷移過程。原癌基因int1與果蠅無翅基因wingless具有同源性，合稱為Wnt。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路調節(jié)某些正常的生理過程和誘導多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展〔15〕。Wnt/β-catenin通路是Wnt信號通路的經典途徑。β-catenin是Wnt/β-catenin通路的核心作用因子，其在細胞質的含量升高并逐漸向核內轉移是該通路的標志。Wnt蛋白可降低β-catenin復合物的穩(wěn)定性，妨礙β-catenin磷酸化降解，從而引起β-catenin在細胞質中積累，轉入細胞核中激活Wnt/β-catenin信號通路，增強下游靶基因的表達〔16〕。E-cadherin是Wnt信號通路的重要調節(jié)因子，主要影響β-catenin的活化。在細胞質中，β-catenin可與E-cadherin結合形成黏附性連接，若阻礙β-catenin與E-cadherin形成黏附連接，能夠影響細胞質中β-catenin的磷酸化水平，從而影響Wnt信號通路發(fā)揮作用〔17〕。研究表明，當E-cadherin的表達量下降會降低細胞間的黏附力，導致腫瘤細胞侵襲、轉移能力增強〔18〕。CyclinD1是Wnt信號通路的下游靶基因，調控細胞周期和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。當胞質內β-catenin積累量較多時，細胞膜的通透性增強，β-catenin進入細胞核，激活靶基因CyclinD1的表達，誘導腫瘤的發(fā)生、發(fā)展〔19〕。研究顯示，CyclinD1表達量升高可調節(jié)乳腺癌細胞侵襲、遷移能力〔20〕。本研究提示MMP-13可能通過抑制Wnt信號通路的激活從而降低細胞侵襲、遷移能力，抑制腫瘤惡化。

綜上，RNA干擾基底細胞癌細胞中的MMP-13的表達可抑制細胞的遷移、侵襲能力，其作用機制可能是通過影響Wnt信號通路的活性發(fā)揮作用。

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