齊 若 周利曉 顧志敏 霍銀平

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院眼科，河南 鄭州 450052)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病嚴(yán)重的并發(fā)癥之一〔1〕。然而，到目前為止，對DR還沒有高效無害的治療措施。 本研究擬觀察銀杏葉多糖(PGBL)對糖尿病動物模型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及其對基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 PGBL(西安天瑞有限公司)；Trizol (生工生物技術(shù)有限公司)；MMP-9、iNOS 引物 (生工生物科技有限公司)；血糖試劑盒，南京建成生物工程研究所。UV-1100紫外-可見分光光度計，北京瑞利分析儀器公司。PCR儀(Thermo賽默飛世爾科技公司，美國)，BH-Nxe-B 型倒置顯微鏡(日本 Olympus Optical 公司)。

1.2動物 購于廣東省實(shí)驗動物中心，SPF級SD大鼠，雄性，30只，體重220～280 g。造模方法：將SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)10 d后，隨機(jī)挑選20只喂養(yǎng)高脂飼料，其余大鼠喂養(yǎng)正常飼料，為正常組(N)。高脂飼料造模45 w后，通過眼靜脈叢取血，前三滴血棄去，檢測其血糖值，空腹血糖>16.7 mmol/L，則模型成立。隨后將糖尿病大鼠隨機(jī)分為模型組(DM)與PGBL組各10只。各組大鼠均飼養(yǎng)在SPF級動物房中，自由飲純凈水。給藥方法：PGBL組中，每只大鼠按150 mg·kg-1·d-1灌胃PGBL溶液。DM組和N組均灌服等體積生理鹽水，連續(xù)12 w。

1.3取材 將每組大鼠處死后取出的右側(cè)眼球，立即放入-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存。在解剖顯微鏡下沿角膜緣后2 mm切開，眼科剪環(huán)形剪開，去除掉眼前節(jié)，利用重力與慣性將玻璃體緩慢去除，視網(wǎng)膜會隨之脫出，將兩者分開即可得到視網(wǎng)膜組織。

1.4葡萄糖耐量實(shí)驗(OGTT) 大鼠禁食12 h，尾靜脈取血一滴，血糖儀測其空腹血糖值(0 min)，然后以2.5 g/kg劑量灌胃大鼠葡萄糖溶液，分別于灌胃后30、60、120、180 min取血測定各組大鼠相應(yīng)時間點(diǎn)血糖值。根據(jù)各時間點(diǎn)的血糖值，繪制血糖時間曲線圖。

1.5視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活計數(shù) 于缺血再灌注損傷前1 d利用熒光金逆行追蹤劑標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。用10%水合氯醛麻醉大鼠，固定頭部，將頭皮沿著頭骨中線旁，約上丘的位置制備2個孔洞，注入熒光金。手術(shù)完成后縫合傷口。于實(shí)驗后處死大鼠，將眼球小心取出，將眼球避光固定于多聚甲酸1 h后，將視網(wǎng)膜取出，鋪于載玻片上，在顯微鏡下計數(shù)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

1.6實(shí)時定量聚合酸鏈反應(yīng) 將眼視網(wǎng)膜組織加入Trizol中勻漿，每1 ml Trizol 加入 0.2 ml三氯甲烷；劇烈混合30 s后，4℃ 12 000 r/min離心10 min，將水相層液體小心轉(zhuǎn)移至新的離心管中；然后加入0.5 ml異丙醇，混合均勻，室溫靜置10 min；隨后4℃，12 000 r/min離心10 min，可見少量RNA沉淀；吸棄上清溶液，用75%乙醇洗滌沉淀兩次；4℃ 7 500 r/min離心沉淀5 min，棄上清，空氣中干燥RNA沉淀，用DEPC水溶解RNA沉淀；取2 μl溶解后的RNA，用紫外分光光度法測定RNA純度及濃度；計算總RNA濃度。將溶解后的RNA按說明試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增。引物iNOS：前向:5′-GCAACATCAGGTCGGCCATTACT-3′,反向:5′-AGCCCAGGTCGATGCACAAC-3′;MMP-9:前向:5′-TGCGCTGGGCTTAGATCATT-3′,反向:5′-TGGATGCCTTTTATGTCGTCTTC-3′;actin:前向:5′-CTGAACCCTAAGGCCAACCGTGAAA-3′,反向:5′-TGAAGCTGTAGCCACGCTCGGTC-3′，擴(kuò)增條件為95℃，2 min；95℃，5 s，60℃，32 s，共40個循環(huán)。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS10.0軟件行單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1PGBL對各組大鼠一般狀態(tài)體重、空腹血糖水平的影響 給藥12 w后，與N組大鼠比較，DM組大鼠活動減少，毛發(fā)枯黃易脫落、脾性暴躁，給予PGBL干預(yù)后，大鼠精神狀況明顯改善，活動較活躍，毛發(fā)光滑不易脫落，進(jìn)食量稍增加，飲水量及尿量均少于DM組。與N組〔(338.6±41.8)g，(6.1±0.7)mmol/L〕相比，DM組大鼠體重〔(217.4±25.2)g〕顯著下降、空腹血糖〔(17.8±2.2)mmol/L〕明顯增高(P<0.01)。PGBL組大鼠與DM組比較，體重〔(256.9±30.1)g〕上升(P<0.05)、空腹血糖〔(14.3±1.6)mmol/L〕明顯下降(P<0.05)。

2.2PGBL對各組大鼠葡萄糖耐量的影響 各組大鼠灌胃葡萄糖后，血糖水平均出現(xiàn)不同程度上升，然后慢慢下降，至180 min血糖值趨于平穩(wěn)。在這一過程中，DM組大鼠各時間點(diǎn)血糖值均高于N組(P<0.01)，在30 min內(nèi)達(dá)到峰值，隨后N組大鼠血糖恢復(fù)到正常狀態(tài)，DM組大鼠在180 min后血糖值仍維持在較高水平；與DM組相比，PGBL組大鼠在給藥的30 min內(nèi)出現(xiàn)血糖峰值，后血糖值逐漸下降，在180 min，PGBL組血糖值均低于DM組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。說明DM組大鼠的糖耐量受損，對血糖的調(diào)節(jié)能力降低，PGBL可以改善這一受損狀況，但不顯著。

與N組相比：1)P<0.05，2)P<0.01；與DM組相比：3)P<0.05，4)P<0.01圖1 各組大鼠OGTT實(shí)驗中各測定點(diǎn)的血糖值

2.3PGBL對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活數(shù)目的影響 DM組大鼠神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活數(shù)目(768.2±84.9)較N組(1 428.1±159.7)明顯下降(P<0.01)，PGBL干預(yù)后，大鼠神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活數(shù)目(1 103.5±123.6)顯著增加(P<0.05)。表明DM組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)減少可能是糖尿病所致，而PGBL可以增加損傷后存活的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目。

2.4PGBL對于視網(wǎng)膜MMP-9及iNOS RNA表達(dá)水平的調(diào)節(jié) DM組大鼠視網(wǎng)膜MMP-9及iNOS RNA表達(dá)水平(0.41±0.11，0.39±0.08)較N組(1.63±0.34，1.42±0.21)明顯下降(P<0.01)，PGBL給藥干預(yù)后，能顯著上調(diào)MMP-9及iNOS RNA表達(dá)(0.82±0.20，0.73±0.15；P<0.05)。說明銀杏葉多糖可以上調(diào)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜MMP-9及iNOS的RNA表達(dá)。

3 討 論

糖尿病最嚴(yán)重的眼部并發(fā)癥就是DR，但其發(fā)病機(jī)制還沒有得到公認(rèn)的解釋。以前科學(xué)界普遍認(rèn)為糖尿病微循環(huán)障礙是引起視網(wǎng)膜缺血缺氧的關(guān)鍵因素〔2〕。目前認(rèn)為DR的發(fā)生大多與各類細(xì)胞因子的異常導(dǎo)致的氧化應(yīng)激有關(guān)，還有學(xué)者提出，醇-肌代謝異常、蛋白激酶C的激活是引發(fā)DR的關(guān)鍵因素〔3〕。近年來，大量研究也表明：糖尿病患者的視功能障礙大多發(fā)生在DR微血管病變發(fā)生以前，因此推斷DR的主要發(fā)病機(jī)制可能由視網(wǎng)膜神經(jīng)元被影響開始，進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)血液平衡失調(diào)，最終導(dǎo)致糖尿病代謝紊亂〔4〕。DR晚期對視力損害非常嚴(yán)重，甚至可能會致盲，遺憾的是，目前醫(yī)學(xué)界對此還沒有全面的認(rèn)識及科學(xué)有效的治療。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突主要是將視覺信號沿視路傳遞到中樞形成視覺，是視網(wǎng)膜對視覺信息處理及傳遞三級神經(jīng)元的重要組成成分。糖尿病患者的視功能狀況與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量和功能有關(guān)〔5～8〕。在DR初期，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)明顯下降，因此有人提出DR可能是神經(jīng)退行性的病變。本實(shí)驗中，PGBL能顯著上調(diào)糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目，刺激其活性，說明PGBL對RGCs有抗凋亡作用。MMPs是一種內(nèi)源性肽酶。神經(jīng)元細(xì)胞的死亡正是由于MMP-9將細(xì)胞與基質(zhì)的連接打破，進(jìn)而導(dǎo)致腦血流屏障被破壞所導(dǎo)致〔6〕。有研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9水平的升高會導(dǎo)致神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷〔9～12〕。在多種眼部炎癥疾病或者神經(jīng)病變性疾病中發(fā)現(xiàn)iNOS有明顯的細(xì)胞毒性，同時，由高眼壓導(dǎo)致的急性視網(wǎng)膜缺血會升高COX-2及iNOS的水平〔13〕。

銀杏葉是近年來國內(nèi)外藥物研究開發(fā)的熱點(diǎn)之一。近年來已發(fā)現(xiàn)PGBL具有很多生物活性。多糖是一種公認(rèn)的無細(xì)胞毒性免疫促進(jìn)劑，有研究發(fā)現(xiàn)，PGBL可顯著激活腹腔吞噬細(xì)胞，有較強(qiáng)的激活非特異性免疫的功能。PGBL能有效清除自由基，有較強(qiáng)的抗氧化作用〔14，15〕。本研究中發(fā)現(xiàn)，PGBL能降低糖尿病大鼠血糖，有效上調(diào)糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目，對DR具有一定的保護(hù)作用，且可能是通過下調(diào)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜MMP-9及iNOS RNA表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

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