王瑋瑤 占素?fù)P 孫傳博 趙 可 金清華

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，吉林 延吉 133002)

阿爾茨海默病(AD)患者海馬會出現(xiàn)以齒狀回區(qū)(DG)體積明顯縮小、神經(jīng)元密度明顯降低、樹突長度明顯變短為主要特征的病理學(xué)改變；在AD模型鼠中，海馬DG也會出現(xiàn)類似的如神經(jīng)元突觸后致密帶厚度變薄、突觸間隙增寬、突觸界面曲率降低等形態(tài)學(xué)改變〔1〕。L-單甲基-精氨酸(L-NMMA)屬于氨基酸類非選擇性一氧化氮(NO)合成酶(NOS)抑制劑，可以有效抑制NOS活性，對NO的生成有較強(qiáng)且全面的抑制作用。NO是細(xì)胞與細(xì)胞之間信息傳遞的重要的調(diào)節(jié)因子，對海馬學(xué)習(xí)記憶的調(diào)解中起重要作用，NO可以通過激活鳥苷酸環(huán)化酶(GC)進(jìn)而促進(jìn)谷氨酸(Glu)的釋放，促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶過程。有研究指出Glu能系統(tǒng)和NO系統(tǒng)的異?？赡苁窃斐葾D學(xué)習(xí)記憶功能障礙的因素之一〔2，3〕。本實(shí)驗(yàn)通過觀察L-NMMA對AD模型大鼠的海馬DG區(qū)Glu含量及空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響，探討AD大鼠模型中NO對學(xué)習(xí)記憶的影響及其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1動物模型的制備 18只成年雌性SD大鼠，體重(270±30)g，隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組(sham)、AD模型(AD)組和AD+L-NMMA(L-NMMA)組，每組6只。采用雙側(cè)卵巢摘除加D-半乳糖腹腔注射的方法來制備AD模型大鼠，方法如下：大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(300 mg/kg)進(jìn)行麻醉，待大鼠深度麻醉后固定在手術(shù)臺上，大鼠取仰臥位。在臍與恥骨前緣的中點(diǎn)處，向后沿著腹底壁的正中線，切開2～3 cm的切口，摘除雙側(cè)卵巢。手術(shù)后第2天開始，每天對大鼠腹腔注射D-半乳糖(60 mg/kg)，持續(xù)6 w。sham組大鼠也進(jìn)行開腹術(shù)，但是找到卵巢之后不進(jìn)行摘除，術(shù)后第2天開始，每天進(jìn)行腹腔注射生理鹽水，持續(xù)6 w。

1.2海馬DG微量透析探針的埋入及Glu含量的測定 AD模型制備成功后的第2天，將大鼠麻醉固定于腦立體定位儀上，將透析所用的外套管，插入到DG上的0.1 cm處(定位坐標(biāo)為：前囟向后退0.34 cm，正中線旁開距離為0.22 cm，深度為0.25 cm)，用牙科水泥將外套管固定在大鼠顱骨表面。將自制的微量透析探針經(jīng)過外套管，垂直插入大鼠海馬DG，并與外套管固定牢靠。探針前端超出套管的長度為0.1 cm，其前端的乙酸纖維素半透膜外徑為0.02 cm，分子量小于50 000 D的物質(zhì)可被濾過，將微量注射所用的玻璃微管，通過連接頭，固定于探針表面到達(dá)DG。在大鼠手術(shù)恢復(fù)1 d之后，將微量透析探針與微量泵相連接(ESP-64，日本Eicom公司)向透析探針內(nèi)注入人工腦脊液灌流(147 mmol/L NaCl，4 mmol/L KCl，2.3 mmol/L CaCl2，pH6.5；1.5 μl/min)，連接大鼠穩(wěn)定30 min后開始收集微量透析樣本，每只動物收集3個管，每管樣本收集10 min。透析樣本的第一次收集結(jié)束之后，開始進(jìn)行為期5 d的Morris水迷宮試驗(yàn)(MWM)，并在每天訓(xùn)練結(jié)束后按上述方法對動物進(jìn)行微量透析。進(jìn)行高效液相色譜分析時，將3 μl OPA(4 mmol/L)誘導(dǎo)劑與12 μl樣本在室溫下充分混合，反應(yīng)2.5 min后抽取10 μl反應(yīng)液，用微量注射針將反應(yīng)液推入生物活性物質(zhì)微量分析系統(tǒng) (HTEC-300，日本Eicom公司)中，然后再通過其高效液相色譜分離柱、電化學(xué)檢測器，得到樣本中Glu的含量。

1.3MWM實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用MWM(上海吉量)對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行檢測。此部分實(shí)驗(yàn)包括定位航行實(shí)驗(yàn)(4 d)和空間探索實(shí)驗(yàn)(1 d)。在訓(xùn)練的前4 d，每天將大鼠分別從不同入水點(diǎn)放入水池，如果大鼠在規(guī)定時限(120 s)內(nèi)能夠找到并爬上站臺，則其逃避潛伏期為自入水后到爬上站臺為止所用時間；若不能則其逃避潛伏期計(jì)為120 s。在第5天的空間探索試驗(yàn)中，撤去隱藏站臺后將大鼠從同一入水點(diǎn)放入水池，記錄大鼠在120 s內(nèi)穿越原站臺區(qū)的次數(shù)。

1.4DG區(qū)微量注射藥物 非選擇性NOS抑制劑L-NMMA(美國Sigma公司)用改良Riger液配成1 μg/μl的溶液，-4℃保存。每天進(jìn)行MWM訓(xùn)練之前以1 μl/min的速度向海馬DG注射L-NMMA(L-NMMA組)或改良Riger液(sham組或AD組)，注入時程為1 min，30 min后開始進(jìn)行MWM訓(xùn)練。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Prism3.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)或單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組海馬DG Glu水平比較 與sham組〔(1.80±0.58)μmol/L〕比較，AD組大鼠海馬DG的細(xì)胞外液中Glu的基礎(chǔ)含量〔(1.63±0.79)μmol/L〕差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，L-NMMA組Glu含量〔(2.23±0.72)μmol/L〕較AD組有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2各組空間學(xué)習(xí)能力比較 隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，除AD組第2天差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，3組大鼠逃避潛伏期均逐漸顯著減小(P<0.05)。第2～4天，AD組逃避潛伏期明顯大于sham組(P<0.05)；L-NMMA組逃避潛伏期明顯低于AD組(P<0.05)。見表1。

表1 各組逃避潛伏期比較

與第1天相比： 1)P<0.05；與sham組相比：2)P<0.05；與AD組相比:3)P<0.05

2.3各組空間記憶能力比較 AD組〔(3.67±0.82)次/120 s〕和L-NMMA組〔(7.83±1.47)次/120 s〕穿越原站臺區(qū)的次數(shù)明顯少于sham組〔(11.17±1.17)次/120 s，均P<0.05〕，L-NMMA組穿越原站臺區(qū)的次數(shù)明顯高于AD組(P<0.05)。

2.4各組Glu含量變化比較 與訓(xùn)練前比較，除第1天差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外AD組Glu含量隨訓(xùn)練天數(shù)的增加而逐漸顯著增加(均P<0.05)，L-NMMA組Glu含量和sham組的變化趨勢一樣，均隨訓(xùn)練天數(shù)的增加Glu含量呈先增加后又降低的趨勢，而且與訓(xùn)練前比較，sham組和L-NMMA 組Glu含量在訓(xùn)練的第2、3天時均明顯增高(P<0.05)。與AD組比較，L-NMMA組第4、5天Glu含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組Glu含量變化比較

與訓(xùn)練前相比:1)P<0.05；與AD組相比：2)P<0.05

3 討 論

認(rèn)知功能障礙是AD最主要的臨床表現(xiàn)之一，而大腦中負(fù)責(zé)認(rèn)知功能的基礎(chǔ)部位是海馬，同時，海馬也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。NO是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的氣體型神經(jīng)遞質(zhì)，海馬中的NO對學(xué)習(xí)和記憶功能具有促進(jìn)作用〔4，5〕。抑制NO系統(tǒng)可有效改善認(rèn)知記憶的受損〔6〕，也可以減弱離體培養(yǎng)的神經(jīng)元的退行性改變〔2〕，在AD大鼠腦內(nèi)NOS的水平明顯降低〔3〕，而激活NO系統(tǒng)后老齡大鼠的學(xué)習(xí)記憶得到明顯改善〔7〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在訓(xùn)練前給AD模型大鼠微量注射L-NMMA后，明顯改善AD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙，AD大鼠海馬DG區(qū)內(nèi)NO可損害空間學(xué)習(xí)和記憶功能，這與正常大鼠狀況相反。AD學(xué)習(xí)和記憶受損的重要原因之一是興奮性氨基酸-Glu的神經(jīng)毒性作用，其機(jī)制可能是Glu過度活化膜上的NMDA受體，激活突觸內(nèi)的Ca2+通道使Ca2+大量釋放，導(dǎo)致神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞中毒〔8〕。海馬DG區(qū)內(nèi)的NO可以作為逆行信使通過增加局部的Glu水平來促進(jìn)主動回避學(xué)習(xí)記憶過程〔9〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Glu在局部大量積聚而影響DG區(qū)正常的突觸傳遞，對大鼠學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶損傷可能與海馬內(nèi)NO促進(jìn)了氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu的過度生成而影響了突觸的正常傳遞有關(guān)，其機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

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