張 劍 韓方菊

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，黑龍江 佳木斯 154002)

糖尿病臨床上以高血糖為主要指標(biāo)，可導(dǎo)致多器官系統(tǒng)損害，尤其以眼、心臟、神經(jīng)、血管、腎損傷最多見〔1〕。糖尿病性眼病最常見類型是白內(nèi)障，它可致患者視力減退，直至失明。目前糖尿病性白內(nèi)障的治療策略仍以手術(shù)為主，但對(duì)于不適于手術(shù)治療的患者，給予相應(yīng)藥物以延緩糖尿病性白內(nèi)障進(jìn)程就顯得格外重要。葛根素是從葛根中分離提取而成的一種中藥成分，主要活性成分為葛根黃酮，具有廣泛的生物活性〔2〕。本實(shí)驗(yàn)分析葛根素治療對(duì)糖尿病性白內(nèi)障大鼠體重、血糖及晶狀體前囊膜腫瘤蛋白(P53)表達(dá)的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料及試劑 清潔級(jí)Wistar 雄性大鼠30只〔體重(180±10)g，北京維通利華〕；鏈脲佐菌素(STZ)，美國(guó)Sigma；葛根素(浙江康恩貝制藥)；P53抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；β-actin和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(北京中杉金橋)。

1.2動(dòng)物篩選 實(shí)驗(yàn)前Wistar雄性大鼠進(jìn)行以下兩項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，達(dá)到者具備造模標(biāo)準(zhǔn)，不符合任一指標(biāo)者棄用：①散瞳后裂隙燈檢測(cè)確認(rèn)晶狀體透明度正常；②空腹采尾靜脈血，測(cè)得血糖濃度<16.7 mmol/L。

1.3模型制備與葛根素干預(yù) 將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組和葛根素治療組各10只。大鼠禁食 24 h后，模型組和葛根素治療組一次性腹腔注射檸檬酸緩沖液(0.1 mmol/L)配置的STZ(60 mg/kg)；對(duì)照組則僅腹腔注射檸檬酸緩沖液。模型組和葛根素治療組于STZ注射后72 h，空腹采尾靜脈血測(cè)量血糖濃度，血糖濃度≥16.7 mmol/L為造模成功，<16.7 mmol/L者棄用。成模后葛根素治療組每日腹腔注射葛根素(140 mg/kg)，對(duì)照組和模型組每日腹腔注射等量生理鹽水。

1.4Western印跡 將晶狀體前囊膜浸入預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌；加入組織裂解液后用勻漿器勻漿、離心，測(cè)定蛋白濃度后取50 μg總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉37℃封閉1 h；PBS-吐溫(PBS-T)洗膜3次×6 min；P53抗體(1∶100)和β-actin抗體(1∶1 000)4℃冰箱過(guò)夜；PBS-T洗膜3次×6 min；二抗(1∶10 000)37℃反應(yīng)30 min；PBS-T洗膜5次×8 min；顯影液顯色后于凝膠成像系統(tǒng)中拍照、分析；用P53與β-actin光密度值之比代表各樣本P53相對(duì)表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1實(shí)驗(yàn)后各組體重變化 實(shí)驗(yàn)后4、8和12 w， 與對(duì)照組比較，模型組和葛根素治療組體重顯著降低(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)后8和12 w， 與模型組比較，葛根素治療組體重顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.2實(shí)驗(yàn)后各組血糖水平 實(shí)驗(yàn)后4、8和12 w， 與對(duì)照組比較，模型組和葛根素治療組血糖水平顯著增高(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)后8和12 w， 與模型組比較，葛根素治療組血糖水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表1 實(shí)驗(yàn)后各組體重變化

與對(duì)照組比較：1)P<0.01;與模型組比較：2)P<0.05；表2同

表2 實(shí)驗(yàn)后各組大鼠的血糖水平

2.3晶狀體P53表達(dá)量 實(shí)驗(yàn)后12 w，對(duì)照組、模型組和葛根素治療組晶狀體前囊膜P53表達(dá)量分別為0.56±0.09、1.13±0.15和0.71±0.11。對(duì)照組顯著低于模型組和葛根素治療組(P<0.01)，模型組顯著高于葛根素治療組(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組晶狀體P53蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

糖尿病性白內(nèi)障發(fā)生機(jī)制是長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)引發(fā)晶狀體微循環(huán)發(fā)生改變，代謝異常和透明性降低〔3〕。晶狀體上皮細(xì)胞主要存在于晶狀前囊膜中，具有維護(hù)晶狀體透明性和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等重要功能〔4〕。Li等〔5〕研究表明，人類和動(dòng)物非先天性白內(nèi)障發(fā)生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)是晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。作為一種腫瘤抑制基因，P53的兩種類型，野生型和突變型分別具有細(xì)胞凋亡的促進(jìn)和抑制作用，上調(diào)B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X 蛋白(Bax)和B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)基因表達(dá)、增加Bax/Bcl-2比值是野生型P53發(fā)揮促凋亡的重要途徑之一〔6，7〕。萬(wàn)麗等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠晶狀體可檢測(cè)到P53、Bax表達(dá)上調(diào)和Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，提示P53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在糖尿病性視網(wǎng)膜病變中發(fā)揮重要作用。葛根素是從葛根中分離提取而成的一種中藥成分，主要活性物質(zhì)為黃酮類化合物葛根黃酮，具有增強(qiáng)免疫力，減輕炎癥反應(yīng)、保護(hù)心肌、降血糖、降血壓，降血脂、抗血小板聚集、抗氧化應(yīng)激等多種功效〔2〕。本研究結(jié)果可見，葛根素可經(jīng)改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)及抑制晶狀體上皮細(xì)胞凋亡而發(fā)揮延緩糖尿病性白內(nèi)障進(jìn)程的作用。

4 參考文獻(xiàn)

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