李 超 史敬璞 史媛媛 賈慧群 李 錦 王 勃

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院麻醉科，河北 石家莊 050017)

阿爾茨海默病(AD)俗稱老年癡呆癥，大量研究表明，β淀粉樣蛋白(Aβ) 誘導(dǎo)產(chǎn)生的慢性神經(jīng)源性炎癥直接或間接影響神經(jīng)再生能力、神經(jīng)可塑性等學(xué)習(xí)記憶，與AD疾病發(fā)生及病程進(jìn)展關(guān)系密切〔1,2〕。大麻素2型受體(CB2R)屬于G蛋白耦聯(lián)受體超家族，主要分布于外周免疫細(xì)胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞，在免疫炎癥方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。大量研究表明，在神經(jīng)退行性疾病模型中，CB2R激動劑具有減輕神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)，改善認(rèn)知功能損傷等神經(jīng)保護(hù)作用〔3～5〕。但關(guān)于CB2R激動劑對AD疾病學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的神經(jīng)可塑性的影響研究較少。本研究通過觀察長期選擇性CB2R激動劑JWH-015預(yù)防給藥對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠空間認(rèn)知功能、AD疾病腦內(nèi)海馬腦區(qū)慢性神經(jīng)性炎癥和神經(jīng)可塑性的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠，購于美國JacksonLab實驗室，由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所新藥評定實驗室繁育飼養(yǎng)。實驗小鼠分籠飼養(yǎng)于清潔級動物飼養(yǎng)房內(nèi)，每籠10～15只，可自由攝食飲水，日光燈照明，每12 h進(jìn)行明暗交替。

1.2主要試劑及儀器 JWH-015(批號041M4613V，美國Sigma公司)；剛果紅染色試劑盒(批號SCBC2869，美國Sigma公司)；兔源抗離子型鈣結(jié)合受體分子(Iba)1多克隆抗體(批號WEE4506，日本W(wǎng)ako公司)；鼠源抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)單克隆抗體(批號2898361，美國Millipore公司)；高爾基染色試劑盒(貨號PK401，美國FD公司)；OCT組織包埋劑、熒光二抗(北京中杉金橋生物有限公司)。Morris水迷宮，北京鼎大生物科技公司；冰凍切片機(jī)(英國Leica公司)；熒光正置顯微鏡(日本Nikon公司)；VS120光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3實驗方法

1.3.1動物分組及給藥 實驗分別選取健康的6月齡APP/PS1小鼠和同齡野生型(WT)小鼠，接受選擇性CB2R激動劑JWH-015(CB1R的Ki值為383 nmol/L，CB2R為13.8 nmol/L)或?qū)φ杖軇?VEH)的處理，隨機(jī)分為溶劑對照組(WT+VEH)、AD模型組(APP/PS1+VEH)、JWH-015處理組(APP/PS1+JWH-015)和JWH-015單藥組(WT+JWH-015)。JWH-015處理組和JWH-015單藥組小鼠接受連續(xù)8 w腹腔注射JWH-015 0.5 mg·kg-1·d-1，溶劑對照組和AD模型組腹腔注射等體積含有1%二甲基亞砜(DMSO)的生理鹽水。

1.3.2Morris水迷宮實驗檢測小鼠定位航行能力 將小鼠分別從Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限邊緣中點，面壁輕輕放入水中，自由探索60 s，記錄小鼠成功登上水下隱藏平臺的時間，即上臺潛伏期。在60 s內(nèi)登上隱藏平臺并停留10 s者，視為成功登上平臺；若未能成功登上平臺的小鼠，則人工將其引導(dǎo)至平臺，并停留10 s，其潛伏期記錄為60 s。每天每只小鼠訓(xùn)練4次，訓(xùn)練的象限順序隨機(jī)且不同，計算每天4個象限的平均潛伏期。

1.3.3Morris水迷宮實驗檢測小鼠空間探索實驗 第6天時去除第Ⅰ象限的水下平臺，從第Ⅲ象限將小鼠放入水池內(nèi)，記錄60 s內(nèi)小鼠穿越原隱藏平臺位置的次數(shù)。

1.3.4免疫熒光實驗檢測神經(jīng)源性炎癥 采用50 mg/kg異戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠，用生理鹽水和4%多聚甲醛由心灌流固定。取出小鼠腦組織，然后置入4%多聚甲醛液4℃固定過夜，OCT包裹后使用冰凍切片機(jī)，作20 μm厚冠狀切面切片。采用免疫熒光法檢測GFAP、Iba1的免疫熒光強度。取腦組織切片于pH6.0檸檬酸鹽緩沖中進(jìn)行高溫?zé)嵝迯?fù)，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后滴加稀釋的一抗，4℃過夜；次日PBS清洗，滴加相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h后PBS清洗，4′-6′-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核后PBS清洗，滴加適量抗熒光猝滅封片劑，加蓋玻片封片保存。各組選取相同位置的5張切片進(jìn)行組織熒光染色，使用Nikon正置熒光顯微鏡于10倍物鏡觀察拍攝海馬腦區(qū)圖片，使用Image Pro Plus 7.0用于分析免疫熒光強度。

1.3.5高爾基染色檢測神經(jīng)可塑性 參照文獻(xiàn)〔6〕，深麻醉下直接斷頭取腦，快速置于5 ml固定液中(A、B等體積混合液配制)，室溫避光保存2 w；將腦組織轉(zhuǎn)于5 ml C液處理，室溫避光保存1 w；使用干冰預(yù)冷的異戊烷將腦組織速凍，切取厚約100 μm含海馬腦區(qū)的冠狀面切片；將切片浸泡于染色液(D液∶E液∶ddH2O=1∶1∶2，現(xiàn)用現(xiàn)配)中，室溫避光孵育10 min；常規(guī)梯度酒精、二甲苯脫水、透明，中性樹脂封片。使用VS120光學(xué)顯微鏡在60倍物鏡下分別拍攝各組腦片。使用image pro plus 7.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測量海馬齒狀回(DG)區(qū)顆粒細(xì)胞單位樹突長度內(nèi)的棘突密度(為減少誤差，統(tǒng)一選擇選擇第一分枝節(jié)點后樹突分枝，長度至少50 μm)。每組小鼠從相同位置的腦區(qū)切片上選取30～45個神經(jīng)元用于進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用Graphpad5.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1CB2R激動劑JWH-015對各組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響 如表1所示，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組小鼠上臺潛伏期不同程度的下降。AD模型組第5天上臺潛伏期和第6天穿臺次數(shù)較溶劑對照組分別延長36.4%和減少50.6%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。JWH-015處理組小鼠第5天上臺潛伏期較AD模型組縮短25.5%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；圖1為各組小鼠定位航行實驗第5天的典型軌跡圖。在第6天空間探索實驗中，JWH-015處理組小鼠的穿臺次數(shù)較AD模型組有增加的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組小鼠每天的平均游泳速度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表1 JWH-015對各組小鼠Morris水迷宮實驗潛伏期和穿臺次數(shù)的影響

與溶劑對照組比較：1)P<0.05；與AD模型組比較：2)P<0.05

圖1 定位航行實驗第5天各組小鼠典型軌跡圖

2.2CB2R激動劑JWH-015對各組小鼠海馬腦區(qū)Aβ斑塊沉積數(shù)目的影響 剛果紅染色結(jié)果顯示，APP/PS1小鼠海馬腦區(qū)均出現(xiàn)明顯的Aβ斑塊，呈淺紅色點片狀。而同齡WT小鼠海馬腦區(qū)均未出現(xiàn)陽性染色斑塊。見圖2。AD模型組和JWH-015處理組小鼠海馬腦區(qū)Aβ斑塊數(shù)目分別為(5.30±0.69)個和(5.15±0.80)個，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，溶劑對照組與JWH-015單藥組均無Aβ斑塊。

圖2 各組小鼠海馬老年斑沉積的典型剛果紅染色圖片(×40)

表2 JWH-015對各組小鼠Morris水迷宮實驗游泳速度的影響

2.3CB2R激動劑JWH-015對各組小鼠海馬腦區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞免疫反應(yīng)性的影響 星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色中，AD模型組小鼠海馬腦區(qū)GFAP免疫熒光強度與溶劑對照組、JM1-015處理組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。小膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色中，AD模型組小鼠海馬腦區(qū)內(nèi)Iba1免疫熒光強度與溶劑對照組、JWH-015處理組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3，圖3。

2.4CB2R激動劑JWH-015對各組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)可塑性的影響 溶劑對照組小鼠海馬DG區(qū)錐體神經(jīng)元棘突密度為〔(10.29±2.20)個/10 μm〕，而AD模型組為〔(9.01±2.30)個/10 μm〕，較溶劑對照組下降12.4%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而JWH-015處理組為〔(9.14±2.07)個/10 μm〕，與AD模型組〔(9.01±2.30)個/10 μm〕差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

表3 JWH-015對各組小鼠海馬區(qū)GFAP及Iba1免疫熒光強度的影響

與AD模型組比較：1)P<0.05

圖3 各組小鼠海馬GFAP、Iba1免疫熒光示意圖(×100)

A：海馬DG區(qū)神經(jīng)元高爾基染色(×400)，B：各組小鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)元棘突的高爾基染色(×600)圖4 高爾基染色結(jié)果

3 討 論

CB2R在腦內(nèi)主要分布于激活的小膠質(zhì)細(xì)胞，并高表達(dá)于AD患者腦內(nèi)，提示其作為腦內(nèi)生理抗感染調(diào)節(jié)靶點的可能性〔6〕。本研究發(fā)現(xiàn)，8月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠較同齡WT小鼠出現(xiàn)典型的空間學(xué)習(xí)記憶能力障礙。有文獻(xiàn)報道，連續(xù)4個月CB2R激動劑JWH-133處理能夠逆轉(zhuǎn)老年APP2576轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠新奇物體識別能力的損傷〔7〕；另有報道，新型CB2R激動劑MDA7處理能夠顯著提高Aβ1～40海馬注射AD模型Morris水迷宮的潛伏期與穿臺次數(shù)表現(xiàn)〔6〕；而本研究顯示，JWH-015預(yù)防性給藥能夠顯著降低APP/PS1小鼠的潛伏期，但對穿臺次數(shù)無顯著性影響，與以往研究〔7〕結(jié)論有所不同。造成這一差異的原因除與模型動物、給藥種類及處理時程有關(guān)外，主要可能與不同藥物激動CB2R對AD小鼠腦內(nèi)Aβ斑塊沉積及神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)的影響程度不同有關(guān)。

Aβ斑塊沉積和慢性神經(jīng)源性炎癥是AD的重要病理特點，也是AD學(xué)習(xí)記憶損傷與病情進(jìn)展的重要原因。研究表明，CB2R激動劑JWH-133及MDA7處理能夠促進(jìn)AD小鼠腦內(nèi)Aβ的清除、降低Aβ的沉積并減輕炎性細(xì)胞的反應(yīng)性〔7〕。但本研究結(jié)果提示JWH-015預(yù)防給藥改善AD模型小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力可能與調(diào)節(jié)海馬腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞免疫反應(yīng)性有關(guān)。

神經(jīng)可塑性是指感知各種內(nèi)外源刺激后腦內(nèi)神經(jīng)元突觸成分、軸突、棘突等發(fā)生結(jié)構(gòu)功能調(diào)節(jié)的重要過程，是維持正常學(xué)習(xí)認(rèn)知功能的重要方面。研究表明，Aβ蛋白的神經(jīng)毒性作用和慢性神經(jīng)源性炎癥可以引起突觸、神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能異常，并導(dǎo)致進(jìn)行性的學(xué)習(xí)記憶能力下降〔8～10〕。本研究結(jié)果提示神經(jīng)可塑性降低可能是Aβ相關(guān)的神經(jīng)源性炎癥引發(fā)AD模型小鼠空間認(rèn)知能力損傷的機(jī)制。盡管有文獻(xiàn)報道，MDA7顯著改善Aβ1～40海馬注射AD模型小鼠海馬CA1區(qū)長時程增強(LTP)〔6〕，但本研究中JWH-015預(yù)防性給藥并未對AD模型小鼠海馬DG區(qū)顆粒細(xì)胞棘突密度產(chǎn)生顯著性影響。原因可能與CB2R激動劑對AD模型小鼠海馬腦區(qū)的神經(jīng)源性炎癥的調(diào)節(jié)程度有關(guān)；而這也可能是JWH-015預(yù)防性處理未能完全逆轉(zhuǎn)的AD模型組Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力損傷的原因，但有待于進(jìn)一步研究。

綜上，CB2R激動劑JWH-015對AD模型小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷有一定改善作用，其作用機(jī)制可能與海馬區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞免疫反應(yīng)性有關(guān)。

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