仇海軍 趙 醒

(承德縣中醫(yī)院外二科，河北 承德 067400)

骨肉瘤與許多肉瘤組織一樣，容易發(fā)生血道轉移，對骨肉瘤相關發(fā)病機制的研究仍是現(xiàn)代醫(yī)學研究的熱點。蛋白激酶B(AKT)〔1～3〕本質是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，AKT蛋白質生物結構含480個氨基酸，PH 結構域位于N端，調節(jié)活性區(qū)位于C端，催化活性區(qū)位于中間，是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信號通路的重要信號分子，可以激活下游分子。該通路激活后，參與完成細胞的生長增殖，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關。脂肪酸合成酶(FASN)〔4〕的主要生物學功能是從頭合成長鏈飽和脂肪酸，機體主要靠飲食中攝取，故FASN的表達水平也較低，在多種腫瘤組織均發(fā)現(xiàn)FASN的表達上調。本研究探討AKT和FASN與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的關系。

1 材料和方法

1.1材料來源 收集承德縣中醫(yī)院及承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨外科2000～2015年手術切除的30例骨肉瘤標本及骨巨細胞瘤標本，由有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生重新切片復診確診，石蠟標本4 μm用于免疫組化檢測。同時收集上述新鮮組織，液氮保存，用于Western印跡檢測。30例骨肉瘤標本中，男19例，女11例；病變位于脛骨上端12例，股骨下端9例，其他部位9例。全部病例經(jīng)臨床病史、X線和病理結合診斷。

1.2免疫組化法 實驗步驟：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，熱抗原修復，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，H2O2溶液消除內源性過氧化物酶的活性，5 μl 10% 山羊血清封閉，滴加一抗，室溫孵育2 h。其后PBS沖洗3次，每次5 min。分別滴加生物素標記二抗，孵育30 min，其后 PBS 沖洗3 次，每次5 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色，蘇木素復染細胞核5～10 s后，分化，反藍，常規(guī)脫水、透明、封片。染色時設立陰性對照(以PBS代替Ⅰ抗)和陽性對照(由試劑公司提供)。一抗為兔抗人單克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。SP試劑盒、DAB顯色劑均購自福建邁新技術有限公司。判斷標準：以細胞核或細胞質出現(xiàn)背景清晰的黃色或棕黃色顆粒為陽性。分為強著色(>95%陽性細胞)，中等著色(51%～95%陽性細胞)，弱著色(2%～50%陽性細胞)，表達缺失(<2%陽性細胞)〔5〕，本實驗中把弱著色與表達缺失視為陰性表達，強著色與中等著色視為陽性表達。

1.3Western印跡檢測 將新鮮組織于冷PBS中洗凈血液，剪碎，加入RIPA裂解液，測定提取液的蛋白含量。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉膜，轉膜完畢于室溫封閉2 h置于含5%脫脂奶粉的TTBS，一抗結合，4℃過夜，洗膜，每次10 min，共3次，二抗結合，化學發(fā)光法檢測。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件包進行χ2檢驗、相關性分析采用直線相關分析。

2 結 果

2.1免疫組化法檢測AKT、FASN在骨肉瘤與骨巨細胞瘤中的表達 FASN蛋白染色陽性物位于細胞質中，AKT的陽性部位位于細胞核和細胞質，均呈深淺不一的棕黃色顆粒。AKT在骨肉瘤中的陽性表達率為70%(21/30)，顯著高于骨巨細胞瘤中的表達〔26.66%(8/30)〕，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.02)。FASN在骨肉瘤中的陽性表達率為56.67%(17/30)，顯著高于骨巨細胞瘤中的表達〔20%(6/30)〕，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.03)。

2.2Western印跡法檢測AKT、FASN在骨肉瘤與骨巨細胞瘤中的表達 AKT在骨肉瘤組織中的相對表達量為0.861±0.072，顯著高于骨巨細胞瘤組織中的表達(0.127±0.008)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，F(xiàn)ASN在骨肉瘤中的相對表達量為0.827±0.059，顯著高于骨巨細胞瘤組織中的表達(0.218±0.012)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

1，2：骨肉瘤；骨巨細胞瘤圖1 Western印跡法檢測AKT，F(xiàn)ASN

2.3AKT、FASN與骨肉瘤臨床病理特征的關系 Western印跡結果顯示，AKT在骨肉瘤中的表達與患者性別、發(fā)生部位均無關，與軟組織浸潤及遠處轉移有關(P<0.05)。FASN在骨肉瘤中的表達與患者年齡、性別、發(fā)生部位均無關，有遠處轉移者表達有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與軟組織浸潤有關(P<0.05)，見表1。

表1 AKT、FASN陽性表達骨肉臨床病理特征關系

2.4AKT、FASN在骨肉瘤中的相關性 AKT、FASN蛋白在骨肉瘤中的表達呈正相關(r=0.81，P<0.01)。

3 討 論

研究表明在多種腫瘤組織中，均發(fā)現(xiàn)FASN的表達上調〔6～8〕，龍新華等〔9〕認為FASN高表達在骨肉瘤轉移中扮演重要的角色，并進一步研究提示，miR-424很可能通過靶向調控FASN基因影響骨肉瘤細胞侵襲和轉移。劉志禮等〔10〕也應用免疫組織化學SP方法，檢測60例骨肉瘤組織中FASN蛋白表達情況，以21例骨軟骨瘤組織作為對照，也提示FASN蛋白在骨肉瘤組織中呈高表達，與骨肉瘤的發(fā)生及遠處轉移密切相關。P13K/AKT信號通路是研究較多的腫瘤相關信號通路〔11，12〕，在多種腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)過度激活，AKT是該通路的關鍵酶之一，其活化依賴于上游分子PI3K的激活，激活后，AKT磷酸化，變成p-AKT活化形式，進而在細胞質或細胞核對其下游蛋白發(fā)揮激活或抑制作用，最終參與細胞生長和增殖、細胞代謝、蛋白質合成等多種生物學功能。彭雅亞〔13〕發(fā)現(xiàn)乳腺癌中AKT表達增高與乳腺癌的浸潤和侵襲轉移有關，卵巢癌中也有類似發(fā)現(xiàn)〔14〕。本文結果顯示AKT的表達與軟組織浸潤及轉移密切相關，F(xiàn)ASN的表達與軟組織浸潤相關，且均在骨肉瘤中表達上調，提示兩種基因可能與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展有關。其可能機制為FASN表達上調能夠通過降低對DDIT4de抑制作用，而使mTOR表達上調，mTOR是P13K/AKT信號通路的重要下游分子〔15〕。

4 參考文獻

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