林國輝 王 燕 楊家盛 王 鈞 陳 艷

(廣東省第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 廣州 510317)

老年人是肺癌的高發(fā)群體，且多伴有多種基礎疾病，治療難度大且預后較差。肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是影響老年肺癌患者治療和預后的重要因素，而肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)指標的監(jiān)測，對患者的治療和預后的評估均有重要的作用〔1～3〕。 高遷移率族蛋白(HMG)B1是一類非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，主要存在于真核生物細胞內(nèi)。釋放到細胞外的HMGB1可參與細胞分化、增殖、遷移及炎性反應〔4,5〕?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是一類可以降解細胞外基質(zhì)的金屬蛋白酶，MMP-9是MMP家族中的一員，可降解Ⅳ型、Ⅴ型膠原和明膠，進而對腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移起到促進作用〔6〕。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-C是一種淋巴管生成因子，可誘導淋巴管和血管生成、生長〔7〕。本研究觀察老年肺癌患者肺癌組織中HMGB1、MMP-9及VEGF-C的表達，進一步研究三種指標與肺癌的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年3月至2017年6月期間廣東省第二人民醫(yī)院收治的老年肺癌患者92例，收集手術(shù)中切除的肺癌組織及其癌旁組織。納入標準：①所有患者經(jīng)臨床病理檢查確診為肺癌；②經(jīng)評估患者生存期>3個月；③初次診斷肺癌；④患者知情同意。排除標準：①接受過放化療治療者；②患有其他惡性腫瘤者；③存在肝、腦、腎等嚴重器質(zhì)性疾病者；④臨床資料不全者。92例肺癌患者中男52例，女性40例，年齡61～83歲，平均(68.65±4.63)歲；組織學類型：腺癌48例，鱗癌44例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例，分化程度：高分化27例，中分化36例，低分化29例。研究標本均在切除后立即處理，避免組織細胞的結(jié)構(gòu)和成分發(fā)生變化，將其置于10%的中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋后進行連續(xù)切片。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會的審批。

1.2免疫組化 取切片，烘烤60 min，采用二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟，梯度酒精水化(100%、95%、80%、70%)，自來水沖洗5 min，重復2次。滴加3%H2O2，避光孵育10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次3 min。浸入枸櫞酸鈉緩沖液中，采用高壓鍋進行抗原熱修復。山羊血清中封閉15 min。用濾紙吸去血清，滴加稀釋好的一抗(HMGB1、MMP-9多克隆抗體購于北京博奧森生物試劑有限公司，VEGF-C多克隆抗體購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，在4℃的環(huán)境下過夜處理，室溫放置60 min，PBS沖洗2次，每次5 min，滴加生物素化的二抗，在37℃的環(huán)境下反應20 min，PBS沖洗2次，每次5 min，滴加鏈霉卵白素+辣根酶標記生物素試劑(SABC)，在37℃的環(huán)境下靜置20 min，PBS沖洗2次，每次5 min。DAB顯色，蘇木素溶液復染10 min，鹽酸酒精分化處理。梯度酒精(80%、95%、100%、100%)脫水處理，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明處理，滴加適量的中性樹膠，封片晾干。

1.3結(jié)果判定 每個切片隨機選取8個視野，在高倍鏡(400倍)下觀察，HMGB1、VEGF-C細胞核和細胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色為陽性，MMP-9細胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色為陽性。統(tǒng)計每個視野下HMGB1、VEGF-C陽性細胞數(shù)量，計算其陽性細胞率，并計算8個視野下的均值，陽性細胞率>20%為陽性表達。MMP-9陽性結(jié)合染色強度和陽性細胞率綜合判斷：陽性細胞率<10%為1分，10% ≤陽性細胞率<50%為2分，陽性細胞率≥50%為3分；染色強度無染色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色記為3分；最后得分為陽性細胞率得分與染色強度得分的乘積，若總得分<3分則為陰性，總得分≥3分為陽性。

1.4統(tǒng)計學方法 應用SPSS22.0軟件，計數(shù)資料進行χ2檢驗，采用Spearman相關(guān)系數(shù)進行相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1肺癌組織及癌旁組織中HMGB1、MMP-9及VEGF-C的表達比較 肺癌組織中的HMGB1、MMP-9及VEGF-C的陽性表達率〔59例(64.13%)，65例(70.65%)，62例(67.39%)〕均顯著高于癌旁組織〔30例(32.61%)，28例(30.43%)，0例〕，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=18.302,29.764,93.508;均P=0.000)。

2.2肺癌組織中HMGB1、MMP-9及VEGF-C的表達與臨床病理特征的關(guān)系 肺癌組織中HMGB1、MMP-9及VEGF-C的表達與年齡、性別、分化程度無關(guān)(P>0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腺癌中的HMGB1、MMP-9及VEGF-C陽性表達率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、鱗癌(P<0.05)。見表1。

表1 肺癌組織中HMGB1、MMP-9及VEGF-C的表達與臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

2.3肺癌組織中HMGB1、MMP-9及VEGF-C表達的相關(guān)性分析 肺癌組織中HMGB1與MMP-9、VEGF-C呈正相關(guān)(r=0.452，0.423；P=0.005，0.007)，MMP-9與VEGF-C呈正相關(guān)(r=0.417，P=0.008)。

3 討 論

相關(guān)研究結(jié)果顯示，2015年我國的肺癌新增病例數(shù)為733.3千人，死亡病例數(shù)為610.2千人，且隨著我國工業(yè)化的進展，環(huán)境不斷惡化，吸煙人數(shù)不斷上升，導致近年來肺癌的發(fā)病率呈遞增的趨勢〔8，9〕。肺癌患者普遍預后較差，蘇靖等〔10〕對732例肺癌患者的生存時間進行分析，結(jié)果顯示患者的1年生存率為60.11%，2年生存率為46.99%，而3年生存率僅為39.89%。肺癌患者在早期癥狀常較輕微，當疾病發(fā)展到一定程度時才感到身體出現(xiàn)明顯的不適，但此時已錯過最佳治療時機，影響患者的治療和預后。另一方面，肺癌易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，使其難以治愈，肺癌的遠處轉(zhuǎn)移是導致患者死亡的重要原因之一〔11，12〕。癌細胞具有生命力強、增殖能力強的特點，且與其他細胞接觸時無接觸抑制現(xiàn)象，這為其遠處轉(zhuǎn)移提供基礎條件，但除此之外，細胞外基質(zhì)與新生血管也與癌細胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

HMGB1是一種與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系的染色質(zhì)蛋白，可提高組織纖溶酶原激活物的活性，提升腫瘤細胞的侵襲能力〔13〕；另一方面，HMGB1與其配體糖基化終產(chǎn)物受體結(jié)合后可激活p38、JNK、p42/p44等信號通路，進而激活MMP-2、MMP-9等多種MMPs，促進細胞外基質(zhì)降解，利于腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移〔14〕。MMP-9被激活后可降解細胞外基質(zhì)的主要成分Ⅳ型膠原，破壞細胞外基質(zhì)，導致腫瘤細胞向周圍組織浸潤，同時MMP-9可促進腫瘤內(nèi)毛細血管的生長發(fā)育，為腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移提供基礎〔15〕。研究顯示〔16〕，MMP-9在肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達，是評估腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要指標之一。VEGF-C在正常情況下僅在消化道黏膜及呼吸道的內(nèi)分泌細胞中呈現(xiàn)低表達，但當肺癌、胃癌、前列腺癌等惡性腫瘤發(fā)生時，其在腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達〔17〕。VEGF-C通過與其受體血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)-2結(jié)合，可促進血管內(nèi)皮細胞遷移和增生，增加血管通透性，VEGF-C與其另一受體VEGFR-3結(jié)合后，可誘導VEGFR-3酪氨酸激酶磷酸化，導致淋巴管增生或擴張〔18〕。因此，VEGF-C是一種能促進淋巴管和血管生成、生長的因子，為腫瘤的生長發(fā)育提供氧氣及營養(yǎng)，進而對其侵襲和轉(zhuǎn)移起到促進的作用。本研究提示肺癌組織中的HMGB1、MMP-9及VEGF-C表達與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學類型有關(guān)。腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移現(xiàn)象一般較鱗癌嚴重，因此HMGB1、MMP-9及VEGF-C的表達也更高，同時也提示可通過檢測HMGB1、MMP-9及VEGF-C水平來甄別腺癌和鱗癌。另外，本研究還顯示，HMGB1與MMP-9、VEGF-C存在一定的內(nèi)在聯(lián)系，但其具體機制還有待進一步的研究。

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