王 焱，蔡 偉，蘭 劍，伏兵哲，高雪芹(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

苜蓿(Medicagosativa)是高產(chǎn)穩(wěn)定、適口性好，營養(yǎng)價值豐富,適應(yīng)性廣的優(yōu)良牧草，被譽為“牧草之王”[1-2]。其具有發(fā)達的根系系統(tǒng)，在地下10 m處也有根系分布，且可以利用土壤深層水，在西北干旱半干旱地區(qū)種植具有較強的抗旱能力[3]。寧夏全區(qū)苜蓿種植面積38.01萬hm2，中南部旱作苜蓿種植面積15.39 hm2，占40.7%[4]，種植面積較大。近年來隨著氣候變暖，水資源短缺，加之寧夏中南部干旱區(qū)干旱少雨，且該地區(qū)種植的苜蓿品種陳舊混亂、抗旱性差、產(chǎn)量低，這些因素嚴重制約了當?shù)剀俎．a(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，篩選抗旱性強的優(yōu)良苜蓿品種，不僅可以解決當?shù)厮亮魇?、土壤風(fēng)蝕等環(huán)境問題，而且可以提高旱作苜蓿的種植水平和產(chǎn)量。

干旱脅迫不僅會影響苜蓿的生長，對后期苜蓿的越冬、產(chǎn)量也有一定的影響。研究苜蓿的抗旱性，對抵抗自然條件對苜蓿發(fā)展的制約及提高苜蓿生存發(fā)展具有重要意義[5]。目前，對苜蓿抗旱性的研究比較多，劉卓等[6]研究報道，試驗測定的指標反映的牧草品種抗旱能力各不相同，這與不同品種適應(yīng)干旱環(huán)境的方式不同有關(guān)。張曦等[7]研究表明，葉面積、比葉重對水分脅迫的反應(yīng)較為敏感。干旱脅迫越嚴重，對葉厚的影響越大。翟春梅等[8]研究表明，SOD，POD和CAT的酶活性對保護紫花苜蓿抵御干旱脅迫有一定的范圍。這些研究都為苜?？购敌栽u價奠定了良好的基礎(chǔ)。以12個苜蓿品種為對象，采用PEG-6000脅迫的方法，對苜蓿苗期的抗旱性進行綜合評價，以篩選抗旱苜蓿品種，為寧夏中南部地區(qū)旱作苜蓿種植提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗苜蓿來源及秋眠級見表1。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)計分兩部分：萌發(fā)期抗旱和苗期抗旱。

1.2.1 萌發(fā)期抗旱試驗設(shè)計 選取均勻一致的12個苜蓿品種種子各50粒，經(jīng)HgCl2消毒，用清水沖洗干凈、晾干，置于有雙層濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中，分別加入不同水勢的聚乙二醇(PEG-6000)溶液。采用PEG-6000模擬干旱法，分別配制12.5%、17.6%、21.1%、23.9%溶液(其對應(yīng)的溶液水勢分別為-0.3、-0.6、-0.9、-1.2 MPa)，試驗對照組(CK)以蒸餾水代替PEG-6000溶液，對照和處理均設(shè)3個重復(fù)。置于人工智能氣候培養(yǎng)箱中，20℃恒溫，光照強度5 000 lx，濕度50%，光照周期12 h/12 h(光照/黑暗)[10]。每日補充對應(yīng)濃度的PEG-6000溶液，每3 d更換濾紙，以保持培養(yǎng)皿內(nèi)滲透勢恒定。發(fā)芽以胚根露白為標準，每隔24 h觀察記錄發(fā)芽種子的數(shù)量。萌發(fā)結(jié)束后(連續(xù)3 d未有新增發(fā)芽種子)測定幼苗和幼根長度，發(fā)芽期為7 d。

表1 試驗苜蓿品種、來源及休眠級Table 1 The source and the fall dormancy grade of alfalfa cultivars

1.2.2 苗期抗旱試驗設(shè)計 在20℃室溫下，采用Hoagland營養(yǎng)液配方水培12個品種苜蓿幼苗100株。水培裝置包括營養(yǎng)液盆、水培筐、沙網(wǎng)、碎石、細砂[11]。播種前設(shè)備和材料均在90℃高溫下滅菌5 h，苜蓿種子經(jīng)HgCl2消毒。當幼苗長至三葉期時進行干旱脅迫。試驗設(shè)置5個水勢0(CK)、-0.3、-0.6、-0.9、-1.2 MPa。處理后每2 d進行稱量補水以維持溶液濃度。處理后第7 d取樣，時間8∶00～10∶00。

PEG-6000溶液不同水勢梯度的計算：

ΨS=-(1.18×10-2)×C-(1.18×10-4)×C2+(2.67×10-4)×C×T+(8.39×10-7)×C2×T

式中：ΨS為溶液的水勢(bar)；C為PEG-6000溶液的濃度(g/kg H2O)；T為溫度(℃)。

依據(jù)公式1bar=0.1 MPa，用試算法計算試驗設(shè)計水勢的PEG-6000溶液濃度。因營養(yǎng)液的濃度很低，可認為其密度與水一致。溫度取均值20℃。計算結(jié)果為1 kg水里溶解143.2 g，PEG-6000水勢為-0.3 MPa；溶解213.6 g，PEG-6000水勢為-0.6 MPa；溶解268.0 g，PEG-6000水勢為-0.9 MPa；溶解313.9 g，PEG-6000水勢為-1.2 MPa[12-13]。

1.3 指標測定

萌發(fā)期指標測定：相對發(fā)芽率=處理種子發(fā)芽數(shù)/對照種子發(fā)芽數(shù)×100%(萌發(fā)第7 d的發(fā)芽數(shù))；相對發(fā)芽勢=處理種子發(fā)芽勢/對照種子發(fā)芽勢×100%(萌發(fā)第5 d的發(fā)芽數(shù))；萌發(fā)指數(shù)(GI)：GI=∑GT/DT(GT為第T天的發(fā)芽數(shù)；DT為相應(yīng)的天數(shù))。

苗期指標測定：葉綠素(chl)含量采用乙醇浸提法；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)顯色法；超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑(NBT)光化還原法；脯氨酸(Pro)含量采用酸性茚三酮法測定[14-15]。

各指標數(shù)值均為相對值。某指標相對值=(處理組/對照組)×100%。

1.4 綜合評價方法

用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)進行耐旱性綜合評價：

X(u)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

X(u)=1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

式中：X(u)為隸屬函數(shù)值；X為某一PEG脅迫處理下某指標的相對值；Xmax 為此指標中的最大值；Xmin為此指標的最小值。若某一指標與耐旱性呈正相關(guān)，用公式(1)，若呈負相關(guān)，用公式(2)計算[16-19]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用DPS v8.01版軟件進行方差分析，聚類分析及回歸分析。用Microsoft Excel 200制圖表和隸屬函數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子相對發(fā)芽率分析

12個苜蓿品種的相對發(fā)芽率隨不同水勢的PEG溶液脅迫下的差異均不顯著，說明12個苜蓿品種的種子在PEG溶液干旱脅迫下均逐漸減少，在-0.3 MPa時，德國德貝最大，為85.97%，在-1.2 MPa，新疆大葉苜蓿最大，為9.39%(表2)。

通過表3回歸分析表明，PEG溶液水勢每降低0.1MPa，苜蓿品種從豐寶至德國德貝的相對發(fā)芽率分別下降8.5%、8.3%、7.8%、7.4%、7.3%、8.4%、8.4%、8.0%、7.7%、7.7%、8.4%、8.4%。苜蓿相對發(fā)芽率與脅迫溶液的水勢之間有極顯著的正相關(guān)關(guān)系，平均相關(guān)值0.983。

表2 苜蓿品種在不同水勢的PEG脅迫溶液下種子的相對發(fā)芽率Table 2 Relative germination percentage of 12 alfalfa cultivars seeds under PEG stress in fifferent water %

表3 苜蓿品種種子相對發(fā)芽率與不同PEG脅迫溶液水勢之間的相關(guān)回歸關(guān)系Table 3 The correlation between the relative germination rate of different alfalfa seeds and the water potential of different PEG stress solutions

2.2 種子相對發(fā)芽勢分析

在PEG模擬干旱脅迫下，苜蓿種子相對發(fā)芽勢隨干旱脅迫程度的增加整體呈下降趨勢，在-0.3 MPa下，有10個品種的相對發(fā)芽勢大于對照，在-0.6 MPa下，除豐寶和新疆大葉苜蓿的相對發(fā)芽勢超過對照外，其余10個品種的相對發(fā)芽勢呈下降趨勢，平均相對發(fā)芽勢為63%；在-0.6 MPa之后，不同品種的苜蓿種子相對發(fā)芽勢隨干旱脅迫程度的增加迅速下降，降幅為86.8%，在-0.9 MPa下有豐寶、苜蓿王1號、德國德貝3個品種的相對發(fā)芽勢為0，在-1.2 MPa下9個品種的平均相對發(fā)芽勢為0。

根據(jù)不同品種苜蓿在不同PEG溶液水勢下的種子平均相對發(fā)芽勢，對12個苜蓿品種的耐旱性進行排序，豐寶>德國德貝>新疆大葉苜蓿>愛菲尼特>寧苜1號>皇后 2000>苜蓿王1號>WL324>大富豪>阿爾岡金>四季旺>West blend。其排序結(jié)果與平均相對發(fā)芽率的排序結(jié)果差距很大，說明苜蓿種子萌發(fā)初期和萌發(fā)后期的發(fā)芽率在干旱脅迫下的差別很大，所以在評價苜蓿耐旱性時，利用相對發(fā)芽率和相對發(fā)芽勢兩個指標共同評價是必須的。

表4 苜蓿品種在不同水勢PEG脅迫溶液下種子的相對發(fā)芽勢Table 4 Relative germination potential of 12 alfalfa cultivars seeds under PEG stress in different water potential %

注：*在0.05水平上顯著；** 在0.01水平上顯著，r(0.05,0.01)=0.878,0.959

2.3 萌發(fā)指數(shù)(GI)分析

12個苜蓿品種的萌發(fā)指數(shù)隨PEG溶液水勢的降低，整體呈下降趨勢(表5)。從CK到-0.3 MPa，12個苜蓿品種的萌發(fā)指數(shù)平均降幅為37.7%，從-0.3MPa到-0.6 MPa，12個苜蓿品種的萌發(fā)指數(shù)平均降幅為51.3%，從-0.6～1.2 MPa，12個苜蓿品種的萌發(fā)指數(shù)迅速下降，平均降幅為92.2%。

表5 苜蓿品種在不同水勢PEG脅迫溶液下種子的萌發(fā)指數(shù)Table 5 Germination index of 12 alfalfa cultivars seeds under PEG stress in different water potential

注：*在0.05水平上顯著；**在0.01水平上顯著，NS為不顯著；r (0.05,0.01)=0.878,0.959

在CK下，12個苜蓿品種間的萌發(fā)指數(shù)差異極其顯著，在-0.6 MPa下，12個苜蓿品種間的萌發(fā)指數(shù)差異顯著，在-0.3，-0.9和-1.2 MPa，12個苜蓿品種間的萌發(fā)指數(shù)差異不顯著；從12個苜蓿品種的萌發(fā)指數(shù)與不同PEG溶液的水勢之間的相關(guān)關(guān)系分析，除豐寶等4個品種的萌發(fā)指數(shù)與PEG溶液的水勢呈顯著的正相關(guān)關(guān)系外，其余8個品種的萌發(fā)指數(shù)與PEG溶液的水勢呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系。

2.4 12個苜蓿品種萌發(fā)期抗旱性評價

以相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢、萌發(fā)指數(shù)3個指標對12個苜蓿品種進行聚類分析(圖1)。

采用最短距離法可將12個苜蓿品種分為3類：抗旱性較強品種為四季旺、West blend；抗旱性適中品種豐寶；抗旱性較低品種WL324、大富豪、阿爾岡金、皇后2000、寧苜一號、苜蓿王1號、新疆大葉苜蓿、愛菲尼特、德國德貝。

圖1 不同苜蓿品種耐旱性聚類分析Fig.1 Cluster analysis of drought resistance of different alfalfa varieties

2.5 干旱脅迫對苜蓿品種丙二醛含量的影響

水勢從-0.3～-1.2 MPa，丙二醛相對含量均值分別為129.67%、179.67%、164.58%、150.83%，隨水勢的變化其值整體呈先上升后下降的趨勢，且不同苜蓿品種間丙二醛相對含量差異顯著(P<0.05)。在-0.6 MPa下，丙二醛相對含量為一個明顯拐點(表6)。當?shù)陀?0.6 MPa時，數(shù)值開始下降，在-0.9 MPa下，丙二醛相對含量較-0.3 MPa降低了26.92%，

表6 干旱脅迫下丙二醛的相對含量Table 6 The variation of relative MDA content under drought stress %

注：數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的相對平均值±標準誤差；同列不同字母表示品種間差異顯著(P<0.05)，下同

在-1.2 MPa時其值比-0.9 MPa降低了9.27%，說明此時細胞開始受到嚴重損傷。

2.6 干旱脅迫對苜蓿品種葉綠素含量的影響

結(jié)果表明，12個苜蓿品種的相對葉綠素含量在不同水勢的PEG溶液脅迫下差異顯著(P<0.05)。從-0.3～-1.2 MPa，葉綠素相對含量均值分別為149.41%、137.5%、177.33%、153.75%。在-0.9 MPa下達到最大值，此后，葉綠素相對含量開始下降，在-1.2 MPa時其值比-0.9 MPa時下降了14.93%(表7)。

在-0.9 MPa時，WL324品種較對照增加了207.52%，增長速度較快，而且綠葉素含量相對值最高，且與7個品種差異顯著(P<0.05)(表7)。

2.7 干旱脅迫對苜蓿品種超氧化物歧化酶活性的影響

在PEG模擬干旱脅迫下，不同苜蓿品種超氧化物歧化酶活性隨干旱脅迫程度的增加整體呈先上升后下降趨勢，從-0.3到-1.2 MPa，超氧化物歧化酶活性均值分別為 85.5%、101.67%、95.08%、67.67%，且12個品種間超氧化物歧化酶活性差異顯著(P<0.05)。在-0.3 MPa下，四季旺品種超氧化物歧化酶活性較對照上升了70.47%，上升速度最快，且與其他品種差異極顯著(P<0.01)。在-0.6 MPa下，寧苜一號酶活性上升較明顯，比在-0.3 MPa時上升了54.03%，說明其降低脂膜過氧化作用較強，抗旱性比較好。而在-1.2 MPa時，除WL324品種較對照上升了16.78%外，其余品種與對照相比，均下降明顯。愛菲尼特在此水勢下相對酶活性數(shù)值為39.44%，與其他品種相比數(shù)值最低，酶活性最弱(表8)。

表7 干旱脅迫下葉綠素的相對含量Table 7 The variation of relative chlorophyll content under drought stress %

表8 干旱脅迫下超氧化物歧化酶的相對活性Table 8 The difference of relative SOD content under drought stress %

2.8 干旱脅迫對12個苜蓿品種相對脯氨酸含量的影響

隨PEG溶液水勢的降低，12個苜蓿品種游離脯氨酸含量整體呈增長趨勢，且不同品種間脯氨酸含量差異性顯著(P<0.05)。在-0.3 MPa下，阿爾岡金品種脯氨酸相對含量明顯高于其他品種，水勢在-0.6 MPa時，苜蓿王1號、寧苜一號、德國德貝、阿爾岡金這4個品種脯氨酸含量均比-0.3 MPa時上升幅度快，分別上升了565%、782%、710%、868%。在-1.2 MPa下，豐寶、WL324、皇后2000、愛菲尼特4個品種的相對脯氨酸含量達到了最大值，分別為556%、593%、758%、1479%(表9)。

2.9 12個苜蓿品種苗期抗旱性的綜合評價

12個苜蓿品種的抗旱性強弱順序依次為：四季旺>寧苜一號>WL324>豐寶>苜蓿王1號>大富豪>West blend>阿爾岡金>德國德貝>皇后2000>新疆大葉苜蓿>愛菲尼特(表10)。

表10 隸屬函數(shù)綜合排序Table 10 Comprehensive ranking of subordinate function

3 討論

植物抗旱性評價指標及方法有很多，根據(jù)其研究目的、測定的指標不同來選擇適合的方法[20]，前人對此已做大量研究。試驗選擇了萌發(fā)期及苗期的不同指標進行抗旱性鑒定評價；并運用回歸、隸屬函數(shù)及聚類方法對苜蓿品種進行抗旱性分析。采用PEG-6000模擬干旱脅迫的方法，采用隸屬函數(shù)、回歸及聚類分析法綜合評價了12個苜蓿品種的抗旱性，篩選出四季旺、豐寶等具有強抗旱性的苜蓿品種。

植物的抗旱性性狀是由形態(tài)生理方面的綜合變化來體現(xiàn)，不同植物對某一具體生理指標的抗旱性反應(yīng)及抗旱性強弱表現(xiàn)均不一定相同，因而孤立的某個指標不能評價植物的抗旱性[22-25]。為了使評價更具準確性，采用萌發(fā)期及苗期不同的7個指標對苜?？购敌赃M行綜合評價，這些指標具有結(jié)果可靠、測定有代表性的特點，能客觀的反映苜蓿在干旱脅迫中生理形態(tài)方面的變化。

試驗?zāi)康募皽y定指標，萌發(fā)期采用方差、回歸、聚類分析，苗期采用隸屬函數(shù)方法進行綜合評價。萌發(fā)期經(jīng)回歸及聚類分析篩選出四季旺、Westblend、豐寶等抗旱性較強的品種。苗期經(jīng)隸屬函數(shù)分析篩選出四季旺、寧苜一號、WL324、豐寶等抗旱性較強的品種。

4 結(jié)論

經(jīng)分析12個苜蓿品種的相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢、萌發(fā)指數(shù)與PEG脅迫溶液的水勢之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，因此，對苜蓿萌發(fā)期進行耐旱性評價時，種子相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢及萌發(fā)指數(shù)是很好的鑒定指標。經(jīng)聚類可將12個苜蓿品種分為3類：抗旱性較強品種四季旺、West blend抗旱性適中品種豐寶；抗旱性較低品種WL324、大富豪、阿爾岡金、皇后2000、寧苜一號、苜蓿王1號、新疆大葉苜蓿、愛菲尼特、德國德貝。

隨著干旱脅迫的增加，12個苜蓿品種的丙二醛、葉綠素含量及超氧化物歧化酶活性整體上均呈先上升后下降的趨勢，脯氨酸含量整體呈現(xiàn)上升趨勢。利用隸屬函數(shù)分析，12個苜蓿品種的抗旱性綜合評價能力強弱依次為：四季旺>寧苜一號>WL324>豐寶>苜蓿王1號>大富豪>West blend>阿爾岡金>德國德貝>皇后2000>新疆大葉苜蓿>愛菲尼特。因此，經(jīng)萌發(fā)期及苗期綜合分析，可篩選出四季旺、豐寶等抗旱性較強的苜蓿品種。

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