馬驄毓，姚 拓(甘肅農(nóng)業(yè)大學 草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

植物根際生存著一類有益菌類[1]，不僅可以固定空氣中的氮氣，還可溶解土壤中不能被植物直接利用的磷元素，或分泌植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，從而促進植物對礦物質(zhì)的吸收和生長發(fā)育[2]。這類細菌被稱為植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，簡稱 PGPR)。通過利用具有固氮、溶磷、活鉀、分泌生長素等功能的植物根際促生菌研制生物菌肥，對改善土壤結(jié)構(gòu)、提高土壤有機質(zhì)含量、改良鹽堿地及環(huán)境保護具有積極作用[3-4]。生物菌肥相比傳統(tǒng)化肥具有成本低、使用安全、持續(xù)效果好、增產(chǎn)穩(wěn)定、非再生能源消耗少、經(jīng)濟效益高、無環(huán)境和食品污染等優(yōu)點。國內(nèi)外有關(guān)微生物肥料已有規(guī)?；纳a(chǎn)，但在不同環(huán)境、不同植物根際的菌株不同，且不同菌株對環(huán)境的適應(yīng)性也不同。因此，借鑒已有研究經(jīng)驗，根據(jù)特定地區(qū)的氣候、植物及環(huán)境，分離篩選高效菌株，從而研究具有地區(qū)針對性的生物菌肥具有重要意義[5-7]。

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)為茄科(Solanceae)枸杞屬(Lycium)多年生灌木，是一種稀鹽鹽生植物，廣泛分布于我國陜西北部黃土高原、寧夏、甘肅、青海、內(nèi)蒙古、新疆和西藏等地區(qū)[8]，在甘肅境內(nèi)主要分布在瓜州、敦煌、金塔和民勤的鹽化荒漠地帶[9]。由于特殊的外部形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征及抗鹽機理，黑果枸杞具有適應(yīng)能力強、抗旱、耐鹽的特點[10]，是待開發(fā)利用的干旱、半干旱地區(qū)植被恢復(fù)重建的生態(tài)與經(jīng)濟樹種[11]。近年來，研究多集中在鹽脅迫下黑果枸杞的生理生態(tài)機制和種子萌發(fā)[12-13]，或干旱條件下黑果枸杞的生理防御機制[14]，以及黑果枸杞的藥用價值和保健作用[15]，目前，對干旱地區(qū)黑果枸杞根際微生物的相關(guān)研究報道較少。

因此，篩選黑果枸杞根際PGPR菌，獲得具有促生特性的優(yōu)良菌株，并將其運用于黑果枸杞專用生物肥料的研制和生產(chǎn)，不僅對促進黑果枸杞的種植業(yè)發(fā)展具有積極意義，而且對改良土壤結(jié)構(gòu)、修復(fù)土壤生態(tài)系統(tǒng)具有重要作用，并為生物肥料下一步開發(fā)利用打下了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

采樣地位于甘肅省民勤縣退耕區(qū)次生草地，試驗于2015年8月在采樣地利用五點法獲取黑果枸杞根際(根系和土壤)樣品，存貯于無菌采樣袋中低溫運輸至實驗室立即進行PGPR菌株分離(4℃保存不超過24 h)。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基用于分離和保存根際細菌[16]；NFM培養(yǎng)基用于固氮菌的分離純化[17]；PKO培養(yǎng)基用于溶解無機磷菌株的分離與純化[18]；蒙金娜有機磷培養(yǎng)基用于溶解有機磷菌株的分離與純化[16,19]。

1.3 方法

1.3.1 根際促生菌的分離與純化 根據(jù)文獻[18]的方法，將根際分為3個部分，即根表土壤(soil adhering to roots,RS)、根系表面(rhizoplan or surface of roots,RP)、根內(nèi)(histoplan or interior of roots,HP)。

稱取樣品2 g，置于50 mL離心管中，注入18 mL 0.85%無菌生理鹽水，振蕩2 min并靜置后即為10-1根表土壤稀釋液，然后依次制備成濃度為10-3，10-4和10-5的稀釋液，備用。用微量移液器分別吸取50 μL已制備好的3個根系區(qū)域的10-3，10-4和10-5稀釋液，接種于滅菌的NFM、PKO和蒙金娜固體培養(yǎng)基上，立即用無菌玻璃涂布器涂抹均勻，根際3個區(qū)域每個濃度均重復(fù)3次，倒置20 min。接種后的培養(yǎng)基置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，用接種針從NFM培養(yǎng)基上挑取生長良好且形狀不同的單個菌落，從PKO和蒙金娜培養(yǎng)基上挑取具有溶磷透明圈的菌落，利用劃線法純化后接種于LB斜面培養(yǎng)基，4℃保存。

NFM培養(yǎng)基中呈黃綠色的菌落，挑取其中單個菌落，并分別接種在新的PKO無機磷、蒙金娜有機磷固體培養(yǎng)基，從而獲得可溶磷的目標菌落。

1.3.2 固氮菌固氮酶活性測定 色譜條件：玻璃柱長2 m，內(nèi)徑0.4 cm，擔體GDX-502，柱溫170℃，檢測器溫度150℃，進樣器溫度140℃，氣體流量為H20.08 kg/cm，空氣0.15 kg/cm，N20.3 kg/cm，檢測器氫火焰離子化檢測器(FID)。

將純的標準C2H4氣體(純度為99.999%)配置為濃度10、25、50、75、100、200、500、1 000 μL/10 mL的C2H4標準混合氣體，用50 μL微量進樣器從C2H4標準混合氣體抽取50 μL注入氣象色譜儀(GC 7890F)進樣柱中，觀察 C2H4峰的峰面積。最后以C2H4濃度為橫坐標，峰面積值為縱坐標作圖，即得到C2H4標準曲線。

酶活計算采用乙炔還原活性參照中國科學院上海植物生理研究所方法進行計算[20]。

1.3.3 溶磷菌溶磷能力測定 (1)定性測定 將活化后的菌株點接種于PKO和蒙金娜固體培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)，在7～10 d時觀察每菌株是否出現(xiàn)溶磷透明圈，并測量每菌株溶磷圈直徑(D)和菌落直徑(d)的比值(D/d)，由比值大小初步判定菌株的溶磷能力；(2)定量測定 在已滅菌的PKO或蒙金娜液體培養(yǎng)基中接種0.5 mL各菌株菌懸液(OD值為0.5)。每菌株3次重復(fù)，不接種為對照。28℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)12 d后，用酸度計測定各個培養(yǎng)液pH值，后將培養(yǎng)液在10 000 r/min、4℃離心15 min后，取其上清液5 mL于150 mL錐形瓶中并加入45 mL 0.5 mol/L NaHCO3和約1.5 g無磷活性炭，封口振蕩 30 min，無磷濾紙過濾。在50 mL容量瓶中加入濾液1 mL、0.5 mol/L NaHCO35 mL以及蒸餾水約30 mL，最后加入5 mL鉬銻抗顯色劑，定容搖勻。顯色30 min后，進行比色，測定D700nm，計算磷濃度(μg/mL)。

1.3.4 PGPR菌株鑒定 (1)生理生化特性測定 將各菌進行接觸酶反應(yīng)、V-P測定、D-葡萄糖產(chǎn)酸、D-木糖產(chǎn)酸、D-木聚糖產(chǎn)酸、葡萄糖產(chǎn)氣、明膠水解、酪朊水解、淀粉水解、檸檬酸鹽利用、吲哚產(chǎn)生、氧化酶測定等試驗，準確觀察并記錄試驗結(jié)果；(2)16S rDNA分子生物學鑒定 用細菌基因組DNA試劑盒(OMEGA，美國)提取各菌DNA；用瓊脂糖凝膠電泳法和紫外分光光度法檢測DNA濃度的測定；擴增引物為細菌16S rDNA擴增的通用引物27F-1492R(27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)，由上海派森諾生物有限公司合成。

擴增體系(25 μL)：10×buffer緩沖液(2.5 mmol/L)2.5 μL，Mg2+(10 mmol/L)1.5 μL ，dNTP(25 mmol/L)0.5 μL ，27F(10 μmol/L)0.5 μL ，1492R(10 μmol/L)0.5 μL ，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，模板DNA(25 ng/μL)2.0 μL，稀釋至25 μL。PCR反應(yīng)程序：93 ℃預(yù)變性3～5 min，94℃變形30 s，55退火60 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30～35次，72℃保溫10 min，4℃保存。DNA Marker為DL200(上海派森諾生物有限公司)，采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測擴增產(chǎn)物并交公司完成。

將測得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中用 megablast進行相似性搜索，并與已報道細菌菌株的16SrDNA序列進行同源性比較，并利用MEGA 5.0生物學軟件構(gòu)建進化距離樹圖，用 Neighbor-Joining進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)整理及制圖采用 Excel 2013，數(shù)據(jù)分析采用 SPSS 17.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際促生菌的分離純化

利用NFM、PKO和蒙金娜選擇培養(yǎng)基分離出生長較快、菌落較大，且具有明顯溶磷圈的菌株。純化后獲得菌株71株，其中固氮菌21株，溶解無機磷菌株30株，溶解有機磷菌株20株。均表現(xiàn)出根表(RP)>根表土(RS)>根內(nèi)(HP)的數(shù)量分布規(guī)律，即表現(xiàn)出很強的根際效應(yīng)(表1)。

表1 黑果枸杞根際促生菌株來源及分布Table 1 Source and distribution of Lycium ruthenicum Murr rhizosphere strains

2.2 PGPR菌株的固氮酶活性

2.2.1 標準曲線 用不同濃度的乙烯混合氣體作為橫坐標，峰面積值作為縱坐標作圖，得到乙烯標準曲線(圖1)。

2.2.2 固氮酶活性測定 經(jīng)乙炔還原法所測定的21株固氮菌株中，有10株菌株的固氮酶活性較為良好(表2)，固氮酶活性在56.48～365.12 nmol C2H4h/mL，且各菌株之間的固氮酶活性差異較大，其中菌株NDRP5的固氮酶活性最高，菌株NDRP3的固氮酶活性最低，共有7個菌株的固氮酶活性大于200 nmol C2H4/(h·mL)。在10株菌株中，7株菌株產(chǎn)酸，1株菌株為中性，2株菌株產(chǎn)堿。

圖1 乙烯標準曲線Fig.1 Standard curve of C2H4

表2 固氮菌株的固氮酶活性Table 2 Nitrogenase activity of nitrogen fixing bacteria nmol C2H4/(h·mL)

2.3 PGPR菌株的溶磷能力

2.3.1 磷標準曲線 分別準確吸取5 μg/mL磷標準梯度溶液，采用鉬銻抗比色法進行顯示、比色，以梯度磷溶液的吸光值(D700nm)為縱坐標，梯度磷溶液的濃度為橫坐標繪制標準曲線(圖2)。

圖2 磷標準曲線Fig.2 Standard curve of phosphorus

2.3.2 菌株溶解無機磷能力 供試的30株菌株中有15株菌株溶磷圈較大，生長速度較快，具有良好的溶解無機磷的能力，有7株菌株為NFM固氮培養(yǎng)基上篩選出的產(chǎn)酸菌株(表3)。通過溶磷圈法定性測定菌株的溶磷圈大小發(fā)現(xiàn)，各菌株D/d值在1.59～3.39，D/d值最大的菌株為NDRS5，D/d值最小的菌株為PDRS1。溶磷量在30.80～574.40 μg/mL，菌株P(guān)DRS1溶磷量最高，菌株P(guān)DRP1溶磷量低，溶磷量高于300 μg/mL的菌株共9株，各菌株在PKO培養(yǎng)基上pH在5.06～6.43，均偏堿性。

表3 菌株溶解無機磷能力測定Table 3 Capacity of strains on inorganic culture medium

2.3.3 菌株溶解有機磷能力 供試的20株菌株中選取溶磷圈較大，生長速度較快的15株進行進一步的試驗，其中，有8株為NFM固氮培養(yǎng)基上篩選出的產(chǎn)酸和中性菌株(表4)。通過溶磷圈法定性測定菌株的溶磷圈大小發(fā)現(xiàn)，各菌株D/d在1.78～3.11，D/d值最大的菌株為MDRS1，最小的菌株是NDRS4。定量測定的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)供試的15株菌株溶解有機磷量分別為64.88～429.38 μg/mL，溶磷量最大的菌株為MDRP3，最小的菌株是MDRS1，溶磷量高于300 μg/mL的菌株共4株。各菌株在蒙金娜培養(yǎng)基上pH4.74～6.20，多數(shù)菌株偏堿性。

表4 菌株溶解有機磷能力測定Table 4 Capacity of strains on organic culture medium

2.4 優(yōu)良菌株鑒定

2.4.1 生理生化鑒定 試驗結(jié)果表明，選取性能較好的6株菌株P(guān)DRS1、PDRP3、NDRS4、NDRP5、NDHP1及MDRP5進行鑒定(表5)。查閱《伯杰細菌鑒定手冊》以及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》后，初步鑒定各菌株為芽孢桿菌屬[21-22]。

注：“+”代表該反應(yīng)為陽性，“-”代表該反應(yīng)為陰性

2.4.2 分子生物學鑒定 綜合生化試驗結(jié)果和分子鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)研究中所分離的菌株生化鑒定結(jié)果和分子鑒定結(jié)果能很好的吻合，說明鑒定結(jié)果準確可靠(表6，圖3)。6株菌株分別屬于芽孢桿菌屬的3個種，其中，PDRS1、PDRP3、NDRP5和NDHP1為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，NDRS4為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)，MDRP3為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。

表6 優(yōu)良PGPR菌株鑒定結(jié)果Table 6 Identification of PGPR

圖3 分離出的溶磷菌株分子系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of the isolated phosphate solubilizing bacteria strains

3 討論

大自然中微生物的種類很多，僅有極少數(shù)的微生物種類得到了鑒定[23]，能在試驗室培養(yǎng)的微生物種類就更少，僅為1%[24]。在傳統(tǒng)方法中對植物根際細菌鑒定分類主要采用微生物培養(yǎng)的方法，即通過觀察細菌培養(yǎng)時的形態(tài)和生理生化指標來完成鑒定[25]。隨著分子生物學的快速發(fā)展和進步，菌株鑒定和分離有了更為可靠快速的方法和手段。目前，最常用的微生物菌種鑒定技術(shù)就是16SrDNA序列分析技術(shù)，能夠較好完成菌株遺傳特性篩選和分子差異比對，現(xiàn)已將鑒定出的細菌的16SrDNA基因信息建立數(shù)據(jù)庫，全部收錄到GenBank等基因數(shù)據(jù)庫。此次研究將生理生化特性與分子生物學方法相結(jié)合后對菌株進行鑒定，結(jié)果更為準確。

在分離、純化具有固氮能力、溶解無機磷和溶解有機磷能力菌株時，發(fā)現(xiàn)各菌株數(shù)量均表現(xiàn)出根表>根表土>遠根土>根內(nèi)的根際分布趨勢，此研究結(jié)果與姚拓等[26-27]、張英及趙小蓉等[28-30]的研究結(jié)果相一致。由此說明PGPR菌株在土壤中的數(shù)量除了受土壤理化性質(zhì)、有機質(zhì)含量、土壤類型、耕作措施等因素影響外，PGPR菌株的分布同時也受植物強烈的根際效應(yīng)的影響。有研究表明接近根表的菌株更容易獲取植物分泌的某些物質(zhì)，從而聚集更多的微生物[31]；同時，由于土壤表層積累的枯葉和根系分泌物較多，使得土壤表層和植物根系表層土壤的細菌生長可以獲得豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[32]。另外，不同植物的根際促生菌組成必然不同，因此，要開發(fā)促生效果良好的促生菌產(chǎn)品，就需從不同地區(qū)不同植物的根際分離，從而選育出具有地區(qū)針對性的優(yōu)良菌株。

獲得的固氮、溶磷菌株經(jīng)鑒定均為芽孢桿菌屬(Bacillus)，該屬除了具有良好的解磷能力[33]，還具有良好的固氮作用和生防作用[34]。大量存在于植物根際，繁殖快速、能分泌高活性的分解酵素，并合成多種有機酸、酶、生理活性等物質(zhì)，成為植物位點和空間微環(huán)境的有力競爭者。孫廣正等[35]分離出的一株枯草芽孢桿菌對油菜菌核病病原菌的抑制率達到了85%。王玉琴等[36]從針茅中分離獲得菌株265ZY4，鑒定為枯草芽孢桿菌，具有溶磷、產(chǎn)IAA等生物學功能，具有較好的開發(fā)潛力。除枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，研究還獲得芽孢桿菌屬的其他一些常見的PGPR菌種，如短小芽胞桿菌(B.pumilus)、蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)[37-38]。研究分離出菌株，參考前人文獻推測其有拮抗病原菌的潛力，對抑制有害微生物的繁殖，降解土壤中的營養(yǎng)成分，改善生態(tài)環(huán)境具有積極作用。

4 結(jié)論

黑果枸杞根際有大量PGPR菌，分布特征表現(xiàn)出根表(RP)>根表土(RS)>根內(nèi)(HP)的根際效應(yīng)；最終獲得71株P(guān)GPR菌，其中固氮菌21株，溶解無機磷30株，有機磷20株；通過對促生特性研究，7株固氮菌株的固氮酶活性大于200 nmol C2H4/(h·mL)，13株溶磷菌株的溶磷量高于300 μg/mL；篩選出綜合性能良好、有進一步開發(fā)利用價值的PGPR菌株6株，經(jīng)鑒定均為芽孢桿菌屬(Bacillus)，其中Bacillussubtilis有4株，Bacilluspumilus和Bacilluscereus各1株。

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