苗陽陽，周 彤,師尚禮，張運(yùn)婷，康文娟(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

紫花苜蓿(Medicagosativa)具有適口性好、蛋白質(zhì)含量高、營養(yǎng)價(jià)值全面、利用年限長等特點(diǎn)，是世界范圍內(nèi)種植面積最大、應(yīng)用最廣的牧草[1]。根瘤菌可與其共生形成根瘤，將大氣中的無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮，從而供給植物營養(yǎng)，形成根瘤。這一共生體系的固氮作用不僅具有巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，同時(shí)在改良土壤肥力、提高作物和牧草質(zhì)量、產(chǎn)量、改善生態(tài)環(huán)境等方面具有重要意義。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，人工接種根瘤菌便成為一種常見的農(nóng)業(yè)措施。但苜蓿結(jié)瘤和固氮受多種內(nèi)在因素(苜蓿品種、根瘤菌種類)和外在因素(接種方法、環(huán)境因素、土壤狀況)影響，接種的根瘤菌難以高效地進(jìn)行結(jié)瘤固氮，難以達(dá)到應(yīng)有的增產(chǎn)效果[2-3]。因此，篩選出攜帶目標(biāo)根瘤菌的苜蓿種子，在生產(chǎn)實(shí)踐中就可免去接種環(huán)節(jié)，實(shí)現(xiàn)了優(yōu)良根瘤菌菌株與優(yōu)良苜蓿品種的精準(zhǔn)高效組合，為提高苜蓿良種生產(chǎn)效益奠定基礎(chǔ)。

研究表明，根瘤菌可以內(nèi)生菌的形式廣泛存在于玉米、水稻、煙草、苜蓿等多種植物的根、莖、葉、莢果皮和種子內(nèi)[4-7]。種子內(nèi)的根瘤菌具有固氮、溶解無機(jī)磷和分泌生長素的能力[8]。根瘤菌可通過植物種子傳播到土壤中，種子是被子植物重要的繁殖器官，與其共生的根瘤菌是在漫長的自然選擇過程中產(chǎn)生的協(xié)同進(jìn)化產(chǎn)物[9]。種子內(nèi)生根瘤菌在構(gòu)建共生固氮體系中比土壤中其他根瘤菌具有明顯的競爭優(yōu)勢(shì)。當(dāng)種子萌發(fā)后胚根首先接觸種子內(nèi)部的根瘤菌即“內(nèi)生根瘤菌”，然后才接觸到“土著根瘤菌”。因此，保證種子內(nèi)根瘤菌的活性和數(shù)量，對(duì)根瘤菌高效固氮及各種促生作用的發(fā)揮具有重大意義。

紫花苜蓿多采用種子繁殖，種子用量很大。其種子粗脂肪含量高，不飽和脂肪酸的含量相對(duì)較低，容易導(dǎo)致種子氧化酸敗而不耐貯藏[10]。在種子保存期間，溫度是保持活力和生活力的關(guān)鍵因素，要想獲得高活力的種子，需要在種子收獲、采后處理、保存、包裝等各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。適宜的溫度還可促進(jìn)種子內(nèi)微生物的繁殖。溫度可直接影響細(xì)菌的生理生化代謝途徑[11-13]，主要是通過影響微生物細(xì)胞內(nèi)生物大分子的活性來影響微生物的生命活動(dòng)[14]。低溫會(huì)減緩或停止微生物的代謝過程，溫度低于冰點(diǎn)時(shí)，可使原生質(zhì)內(nèi)的水分結(jié)冰，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15]。

雖然國內(nèi)外對(duì)溫度和貯藏條件對(duì)種子活力的影響已有研究，但關(guān)于不同溫度下不同包裝材料對(duì)種子內(nèi)微生物尤其是根瘤菌的影響較少。因此，以不同接種方法收獲的含目標(biāo)根瘤菌的紫花苜蓿種子為試驗(yàn)材料，在不同溫度下采用不同的包裝條件貯藏，探討利于保持種子內(nèi)根瘤菌的活性和增殖的條件，明確不同貯藏方法對(duì)種子內(nèi)根瘤菌定殖數(shù)量的影響，從而篩選出最適貯藏條件，為獲得含有大量攜帶有目標(biāo)根瘤菌的苜蓿種子奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試苜蓿種子獲得：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草實(shí)訓(xùn)基地生長4年的甘農(nóng)5號(hào)紫花苜蓿(Medicagosativacv.Gannong No.5) ，在結(jié)莢期以主根輕微損傷澆灌、根部直接澆灌、加入600 mg/mL苦參堿(濃度1.3%)澆灌3種根部接種方法接種兩種熒光標(biāo)記根瘤菌EnsifermelilotiLZgn5f (gn5f)和Ensifermeliloti12531f (12531f)，同時(shí)根部澆灌無菌蒸餾水獲得的種子。室內(nèi)風(fēng)干2個(gè)月進(jìn)行貯藏。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 含熒光標(biāo)記根瘤菌種子的貯藏 于2014年11月初進(jìn)行種子貯藏。采用鋁箔紙(種子用雙層鋁箔紙密封包裝)、信封+布袋(種子裝于布袋內(nèi)，外加信封袋)、信封袋3種包裝方式，分別在25℃、25℃硅膠干燥、-4℃和4℃下貯藏6個(gè)月。

1.2.2 種子內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量的測(cè)定 隨機(jī)挑選各處理種子25粒，重復(fù)4次，置于50 mL無菌三角瓶內(nèi)，碘伏 (有效碘濃度為2500 mg/L)浸泡3 min，無菌蒸餾水沖洗4次，每次1 min。操作均在無菌操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。表面消毒后，將最后1次消毒的種子各面在固體培養(yǎng)基平板上放置30 min后取出，將平板28℃條件下培養(yǎng)24～48 h，未長出菌落，表明已徹底消毒[5]。將消毒后的種子置于無菌研缽中，加入2 mL無菌水研磨，吸取0.2 mL研磨至1.8 mL無菌蒸餾水中，制成10- 1稀釋液，再吸取該稀釋液0.2 mL至1.8 mL無菌蒸餾水中，制成10-2稀釋液，按照上述方法依次制成10-3和10-4濃度稀釋液，每一濃度梯度3 次重復(fù)，離心(4 000 r/min，離心2 min)后分別吸取0.2 mL上清液均勻涂布于含剛果紅的YMA固體培養(yǎng)中，28℃培養(yǎng)24～48 h記錄每皿中單菌落數(shù)量(剛果紅YMA培養(yǎng)基中，根瘤菌形態(tài)為含有粘質(zhì)胞外多糖且不吸附色素的白色半透明菌落，形態(tài)為平坦凸起或半透明凸起，邊緣光滑)[16]。挑取每皿內(nèi)大小形態(tài)一致的具代表性的菌落，編號(hào)保存，進(jìn)行革蘭氏染色及形態(tài)學(xué)鏡檢[17]，初鑒別確定為根瘤菌后根據(jù)何慶元等[18]的方法進(jìn)行保存并回接鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007整理數(shù)據(jù)并作圖，采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏方法對(duì)主根微破損接種gn5f和12531f獲得的種子內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量的影響

主根微破損接種gn5f時(shí)獲得的種子，信封包裝貯藏在-4℃時(shí)，內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量最高，為25.54 cfu/粒，顯著高于信封+布袋和鋁箔的2種包裝材料(P<0.05)。信封+布袋包裝貯藏各溫度下定殖的數(shù)量無顯著差異(P>0.05)，為1.74～5.34 cfu/粒。鋁箔包裝時(shí)，25℃干燥貯藏條件下定殖數(shù)量為13.28 cfu/粒，顯著高于其他3種貯藏溫度(P>0.05)。

主根微破損接種12531f時(shí)獲得的種子，鋁箔包裝貯藏在-4℃時(shí)，內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量最高，為14.98 cfu/粒，但與另外兩種包裝材料無顯著差異(P>0.05)，其余3個(gè)溫度下定殖的根瘤菌數(shù)量無顯著差異(P>0.05)。以信封包裝貯藏時(shí)各溫度下定殖的數(shù)量無顯著差異(P>0.05)，為0～1.58 cfu/粒。信封+布袋包裝時(shí)，在4℃干燥貯藏條件下定殖數(shù)量為5.48 cfu/粒，顯著高于其他3種溫度(P>0.05)。

表1 不同貯藏方法處理下主根微破損接種獲得的種子內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量Table 1 Effect of various storage methods on the colonization quantity of endogenous rhizobia in seed inoculated with taproot slightly damaging and drench treatment cfu/粒

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同列不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)，同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 不同貯藏方法對(duì)根部澆灌接種gn5f和12531f獲得的種子內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量

根部澆灌接種gn5f時(shí)獲得的種子，當(dāng)以信封包裝并貯藏在25℃干燥條件下時(shí)內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量最多，為22.08 cfu/粒，顯著高于其他貯藏溫度和包裝材料(P<0.05)。當(dāng)以信封+布袋包裝貯藏于-4℃時(shí)種子內(nèi)gn5f定殖數(shù)量為12.22 cfu/粒，顯著高于其他3個(gè)溫度下定殖的數(shù)量(P<0.05)。鋁箔包裝-4℃貯藏條件下gn5f定殖數(shù)量最多，為9.34 cfu/粒，但與在25℃下貯藏?zé)o顯著差異 (P>0.05)(表2)。

根部澆灌接種12531f獲得的種子，以信封+布袋包裝并在25℃干燥條件下貯藏時(shí)內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量最多，為40.84 cfu/粒，顯著高于其他貯藏溫度和包裝材料(P<0.05)。以信封和鋁箔包裝時(shí)，25℃干燥貯藏時(shí)種子內(nèi)定殖的12531f數(shù)量顯著高于其他3個(gè)溫度(P<0.05)，為1.28～19.64 cfu/粒(表2)。

表2 不同貯藏方法處理下根部澆灌接種獲得的種子內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量Table 2 Effect of various storage methods on the colonization quantity of endogenous rhizobia in seed inoculated with root drench treatment

2.3 不同貯藏方法對(duì)添加苦參堿根部澆灌接種gn5f和12531f獲得的種子內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量的影響

添加苦參堿根部澆灌接種gn5f時(shí)獲得的種子，以鋁箔包裝并貯藏在-4℃時(shí)內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量最多，為25.00 cfu/粒，顯著高于其他貯藏溫度和包裝材料(P<0.05)。以信封包裝時(shí)，貯藏于25℃干燥條件下時(shí)種子內(nèi)gn5f定殖數(shù)量為15.40 cfu/粒，顯著高于其他3個(gè)貯藏溫度(P<0.05)。以信封+布袋包裝貯藏于25℃干燥條件下時(shí)種子內(nèi)gn5f定殖數(shù)量最多，僅為7.66 cfu/粒，且僅顯著高于25℃時(shí)的定殖數(shù)量(P<0.05)(表3)。

添加苦參堿根部澆灌接種12531f時(shí)獲得的種子，以鋁箔包裝貯藏于25℃干燥條件下時(shí)內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量最多，為18.08 cfu/粒，顯著高于其他貯藏溫度和包裝材料(P<0.05)。以信封包裝時(shí)種子內(nèi)12531f的定殖數(shù)量在各貯藏溫度間無顯著差異(P>0.05)，為0～4.94 cfu/粒。信封+布袋包裝，4℃貯藏時(shí)種子內(nèi)定殖的12531f數(shù)量顯著高于其他3個(gè)溫度(P<0.05)，為5.34 cfu/粒。

2.4 不同貯藏方法對(duì)根部澆灌接種無菌蒸餾水獲得的種子內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量的影響

根部澆灌接種無菌蒸餾水獲得的種子，以鋁箔包裝并在25℃貯藏時(shí)內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量達(dá)最多，為10.42 cfu/粒，顯著高于其他貯藏溫度和包裝材料(P<0.05)，4℃貯藏時(shí)定殖數(shù)量次之，為6.48 cfu/粒，其余2個(gè)溫度下定殖的根瘤菌數(shù)量無顯著差異(P>0.05)。信封和信封+布袋在各處理溫度下種子內(nèi)根瘤菌的定殖數(shù)量在1.20～5.32 cfu/粒(表4)。

表3 不同貯藏方法處理下添加苦參堿根部澆灌接種獲得的種子內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量Table 3 Effect of various storage methods on the colonization quantity of endogenous rhizobia in seed inoculated with matrine treatment

表4 不同貯藏方法處理下無菌蒸餾水根部澆灌接種獲得的種子內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量Table 4 Effect of various storage methods on the colonization quantity of endogenous rhizobia in seed inoculated with sterile distilled water treatment

3 討論

根瘤菌是一種能與宿主植物互利共生的有益內(nèi)生細(xì)菌，它可通過植物皮層進(jìn)入木質(zhì)部導(dǎo)管中，隨宿主的生長被運(yùn)送到植物上部營養(yǎng)器官或繁殖器官中[19]。種子是豆科植物的主要繁殖器官，可進(jìn)入新的土壤環(huán)境，成為下一代新植株內(nèi)生根瘤菌的重要來源，為豆科植物-根瘤菌共生體系的構(gòu)建提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，可促進(jìn)次代植株的生長、改善土壤環(huán)境。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)根瘤菌可通過主根微破損、根部澆灌、添加苦參堿根部澆灌的方法進(jìn)入到苜蓿種子內(nèi)，但因接種的目標(biāo)根瘤菌遺傳特性不同，所適宜的接種方法也不同[20]。12531f的原始菌株12531為慢生型根瘤菌，代謝速率慢，而gn5f的原始菌株gn5為快生型根瘤菌，代謝速率快，二者遺傳性狀差異較大。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同方法接種根瘤菌后獲得的種子，在適宜的包裝和溫度貯藏條件下，種子內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量高于接種無菌蒸餾水獲得種子的，表明接種目標(biāo)根瘤后可增加苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌的定殖數(shù)量。接種gn5f獲得的種子在貯藏時(shí)，以信封或是鋁箔包裝時(shí)種子內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量多于信封+布袋，尤其是主根微破損接種獲得的種子在-4℃信封貯藏時(shí)內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量最多；接種12531f獲得的種子以信封+布袋或是鋁箔包裝時(shí)種子內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量多于信封包裝，尤其是根部澆灌獲得的種子在25℃干燥以信封+布袋貯藏時(shí)內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量最多。

祁娟[2]發(fā)現(xiàn)在-20℃處理下，所有供試苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌均不能存活，且在此低溫段，其他雜菌數(shù)量也很少，說明在-16℃～20℃存在著苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌存活的一個(gè)低溫臨界點(diǎn)，低于此溫度臨界點(diǎn)，苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌生長受阻。適宜的溫度下微生物才能生長繁殖，過高或過低的溫度均不利于微生物的生長和增殖，甚至死亡[21]。密封保存對(duì)毛竹種子生活力保存具有重要意義，空氣相對(duì)濕度較高的環(huán)境下保存，種子將從空氣中吸收水分而導(dǎo)致生活力下降[22]。蔡春菊等[23]同樣發(fā)現(xiàn)，在4℃保存2年的毛竹種子，雙層鋁箔袋密封并內(nèi)置硅膠干燥的塑料盒內(nèi)保存比牛皮紙袋保存的毛竹種子，更有利于延長種子壽命。

25℃干燥和-4℃貯藏時(shí)種子內(nèi)根瘤菌數(shù)量高于25℃和4℃，可能是因?yàn)樘砑庸枘z后降低了種子含水量，使一些核酸、酶類的分解代謝和次生產(chǎn)物的積累變緩，此時(shí)的種子可為根瘤菌提供一定的養(yǎng)分和良好的生長環(huán)境，因此，根瘤菌數(shù)量高于相同溫度時(shí)未干燥的處理。在4℃時(shí)種帶部分雜菌生長受到抑制，而-4℃時(shí)則大部分雜菌的生長受到抑制，但根瘤菌則能正常生長，因此-4℃時(shí)種子內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量多于4℃。3種包裝材料中，信封可使種子與外界環(huán)境進(jìn)行充分的氧氣接觸，進(jìn)行自由呼吸；信封+布袋可使種子進(jìn)行適度的呼吸和與外部環(huán)境間的水熱交換；鋁箔則隔離外界水汽和熱量的效果較好，從而使種子處于相對(duì)干燥環(huán)境。但因收獲的種子含目標(biāo)根瘤菌不同，所適宜的包裝材料也不同。

4 結(jié)論

綜合分析，接種gn5f獲得的種子在貯藏時(shí)，以信封或是鋁箔包裝時(shí)種子內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量多于信封+布袋，尤其是主根微破損接種獲得的種子在-4℃以信封貯藏時(shí)內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量最多；接種12531f獲得的種子以信封+布袋或是鋁箔包裝時(shí)種子內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量多于信封包裝，根部澆灌獲得的種子在25℃硅膠干燥以信封+布袋貯藏時(shí)內(nèi)生根瘤菌定殖數(shù)量最多。但因收獲的種子含目標(biāo)根瘤菌不同，所適宜的包裝材料不同。含相同目標(biāo)根瘤菌的種子以25℃干燥和-4℃貯藏時(shí)種子內(nèi)根瘤菌數(shù)量高于25℃和4℃。

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