林曉曉，蔡喆，林光勇

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 藥學部，浙江 溫州 325027）

水凝膠因其自身的特性（良好的生物相容性、力學特性、水滲透性及表面特性等）使其（溫度、pH值、光等刺激-響應(yīng)性超分子水凝膠）在生物醫(yī)學領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[1-3]，超分子水凝膠是一類物理水凝膠，它是由化合物分子通過分子間的非共價相互作用（例如氫鍵作用、疏水作用、π-π堆積作用、靜電作用、金屬離子配位作用以及主客體作用等）在水溶液中自聚集形成的，具有良好的可降解性和觸變性，被廣泛應(yīng)用于可注射藥物載體等方面的研究[4-6]。環(huán)糊精（cyclodextrin，CD）是一類由D-吡喃葡萄糖單元通過α-1，4糖苷鍵首尾相連而成的大環(huán)化合物，用于疏水性藥物的負載和控釋研究[7-8]，合用水凝膠，可望改善水凝膠中藥物攜載量和緩釋行為。但是到目前為止，基于CD主客體包合物的超分子水凝膠親水性藥物及生物大分子的緩釋，僅有少數(shù)的報道是關(guān)于抗腫瘤藥物的運載。

本研究利用己內(nèi)酯化學修飾的聚乙二醇前藥分子（MPEG5000-PCL5000）與α-環(huán)糊精（α-CD）的主客體相互作用，將疏水性抗癌藥物紫杉醇（paclitaxel，PTX）原位包埋于水凝膠中。同時通過流變、電鏡、X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）等測試手段研究凝膠體系的微觀結(jié)構(gòu)、理化特征、體外釋藥行為等，初步探索超分子水凝膠作為抗腫瘤藥物載體的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料 聚乙二醇單甲醚（monomethyl polyethylene ether glycol，MPEG，相對分子質(zhì)量5 kDa）、辛酸亞錫[Sn（Oct）2]和ε-己內(nèi)酯（ε-CL）購自美國Sigma公司。MPEG5000-PCL5000嵌段共聚物（MPEG/PCL=5 000/5 000；相對分子質(zhì)量10 kDa）的合成參照本課題之前的研究[9]。通過疏水性熒光探針測得文中所用MPEG5000-PCL5000嵌段共聚物的膠束濃度（critical micelle concentration，CMC）為0.000457 g/L（見圖1）。α-CD和PTX購自德國J&K科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。所有溶劑皆為分析純，直接使用。

圖1 MPEG5 000-PCL5 000嵌段共聚物的I337/I334與log C強度比值圖

1.2 膠束的制備與表征 膠束的合成參照文獻[10]的共沉淀方法。將1.8 g MPEG5000-PCL5000嵌段共聚物和0.2 g PTX一起溶解于10 mL丙酮溶液，攪拌均勻后，再通過真空旋蒸除去多余的有機溶劑，可得到透明質(zhì)膠。再把此透明質(zhì)膠重新溶解于20 mL 55 ℃去離子水中，反應(yīng)結(jié)束后將其過濾除去不溶物，得到含PTX的MPEG5000-PCL5000膠束，產(chǎn)物于-50 ℃條件下凍干。PTX的MPEG5000-PCL5000膠束中載藥量測定：采用高速離心法測定藥物PTX載藥量，取一定量含PTX的MPEG5000-PCL5000膠束凍干粉，蒸餾水復(fù)溶。膠束溶液經(jīng)100 000×g離心50 min，HPLC測定上清液中PTX含量。PTX載藥量的計算公式為：

PTX載藥量（%）=[mPTX（總）-mPTX（上清）]/[mPTX（總）+mMPEG5000-PCL5000]×100% （ 公式一）

1.3 載藥超分子凝膠的制備 將一定質(zhì)量的含PTX的MPEG5000-PCL5000膠束[20%（w/v）（]w/v為質(zhì)量濃度為200 g/L的PTX）與α-CD[20%、15%和10%（w/v）]分別溶解于蒸餾水中，然后將兩者等體積混合，室溫條件下攪拌均勻并靜置過夜，凝膠逐漸形成。同時用反向試管法測凝膠時間[11]。

1.4 載藥超分子凝膠的表征

1.4.1 XRD：凍干后的凝膠樣品的XRD表征采用Bruker AXS/D8型XRD儀，銅靶（Cu），設(shè)定激發(fā)電壓40 kV，電流40 mA，掃描范圍2θ=5°～60°。

1.4.2 掃描電子顯微鏡：利用掃描電子顯微鏡（s-4800，日本日立公司）對凍干后的凝膠樣品的形態(tài)學變化進行監(jiān)測。

1.4.3 流變性質(zhì)：樣品的流變性質(zhì)采用AR-2000高級流變擴展系統(tǒng)（美國TA儀器公司）進行表征，采用40 mm平行板夾具，水浴控溫于25 ℃。樣品的凝膠化動力學采用動態(tài)時間掃描模式進行表征，掃描范圍為0.1～100 rad/s；凝膠樣品的觸變性采用穩(wěn)態(tài)剪切掃描和觸變環(huán)掃描進行表征，穩(wěn)態(tài)剪切掃描時其速率范圍為0.01～10/s。

1.5 體外釋放實驗 在透析袋（3 500 kDa）中加入1 mL含PTX的超分子凝膠溶液，待凝膠成型后，將透析袋浸入含5 mL PBS緩沖釋放介質(zhì)試管中，然后將試管置于37 ℃的恒溫振蕩水浴箱中進行體外釋放實驗，振蕩速率為100次/min。分別在不同時間點，從試管的釋放介質(zhì)中小心取出1 mL釋放介質(zhì)，剩下的4 mL丟棄，然后將新鮮的5 mL PBS補加到試管中繼續(xù)實驗。利用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC，美國Agilent公司，反相C18柱子，直徑×高為4.6 mm×150 mm，填料粒徑為5 μm）測量釋放液在227 nm處的吸光度，計算得到MPEG5000-PCL5000的體外釋放曲線。HPLC檢測時流動相為乙腈/水=45/55（v/v），流速為1 mL/min。

1.6 體外細胞實驗 PTX用DMSO溶解，含PTX的超分子水凝膠用PBS溶解，α-CD用水溶解，所有溶液均用0.22 μm的濾膜過濾除菌。收集對數(shù)期肺癌細胞（A549），調(diào)整細胞懸液濃度，然后將細胞種于96孔平底板中，將待測細胞密度調(diào)至1×104個/孔。將細胞在5% CO2、37 ℃條件下孵育24 h，使細胞貼壁呈單層生長。然后向每孔加入適當濃度藥物樣品，使藥物樣品的終濃度在0.001～1 μg/mL。將細胞在5% CO2、37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)的培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在570 nm處測量各孔的吸光度值。

1.7 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，樣本均數(shù)之間的比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 膠束的制備與表征 MPEG5000-PCL5000膠束和含PTX的MPEG5000-PCL5000膠束均呈乳白色，但是它們的平均尺寸是不一樣的，分別為（99.56±1.03）nm和（103.67±2.12）nm（見圖2）。載藥量實驗測定結(jié)果表明，PTX的MPEG5000-PCL5000膠束的最大載藥量是18.8%。圖3所示的XRD圖譜證實了PTX確實已被成功地包合進MPEG5000-PCL5000中，在含PTX的MPEG5000-PCL5000膠束中，PTX的特征峰消失了。

2.2 超分子凝膠的制備 如圖4所示，將含PTX的MPEG5000-PCL5000溶液與α-CD溶液在室溫條件下混合均勻，體系靜置一段時間后可形成倒置不流動的凝膠。反向試管法實驗結(jié)果表明α-CD/MPEG5000-PCL5000凝膠所需要的時間依賴于體系中α-CD的數(shù)量（見表1），當CD的數(shù)量由5%增加到10%（w/v）時，凝膠時間由～45 min減少到～8 min。重要的是，所獲得的超分子水凝膠無論是在室溫或者4 ℃保存7 d，其膠的形態(tài)并不會發(fā)生改變，該結(jié)果表明本研究所制備的超分子水凝膠是熱不敏感型的凝膠。

圖3 PTX和含PTX的MPEG5 000-PCL5 000膠束的XRD圖譜

圖4 MPEG5 000-PCL5 000膠束和αCD在水溶液中通過包合作用形成超分子水凝膠

表1 在相同體積的α-CD/MPEG5 000-PCL5 000中混合和凝膠結(jié)果

2.3 表征

2.3.1 XRD分析：圖5所示的XRD圖譜證實了凝膠結(jié)構(gòu)中這種超分子結(jié)構(gòu)的形成，與單純的MPEG5000-PCL5000在2θ=19.2°、21.3°和23.3°處出現(xiàn)了PEG和PCL的特征結(jié)晶峰不同，凝膠樣品在2θ=11.8°、19.2°、21.7°和23.3°處出現(xiàn)了特征衍射峰。

2.3.2 電鏡觀察：如圖6所示，本研究所制備的超分子水凝膠凍干后進行掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)空白和載藥的超分子水凝膠均具有多孔結(jié)構(gòu)，孔徑大小在100～150 μm，這種結(jié)構(gòu)保證了藥物能夠通過擴散的方式進行釋放。

圖5 MPEG5 000-PCL5 000膠束、α-CD和凍干的α-CD/MPEG5 000-PCL5 000水凝膠的XRD圖譜

圖6 超分子水凝膠凍干品的掃描電鏡圖像

2.3.3 流變性質(zhì)：為研究CD數(shù)量對超分子凝膠流變性質(zhì)的影響，首先對其進行動態(tài)應(yīng)變掃描以確定其線性粘彈范圍。圖7A-C所示為α-CD與MPEG5000-PCL5000通過主客體相互作用形成的超分子水凝膠的典型的動態(tài)應(yīng)變掃描曲線。從圖中可以看出，在起始階段，所有凝膠樣品的粘性模量（G''）均要比彈性模量（G'）要高，這也表明所有的凝膠樣品是處于溶膠的狀態(tài)。隨著時間的推移，G'比粘性模量G''增加得更快，導(dǎo)致了2條曲線交叉點的出現(xiàn)，這表明超分子凝膠由溶膠到凝膠的一個轉(zhuǎn)變。在2條曲線相交的位置，表明由MPEG5000-PCL5000與α-CD形成的凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)逐漸形成。同時G＞G''，也證實是凝膠的狀態(tài)。將G'和G''曲線在某一時刻相交的位置作為凝膠點，對應(yīng)的時間即為體系的凝膠化時間。研究發(fā)現(xiàn)，降低α-CD的含量能增加凝膠化時間。當α-CD的含量為20%（w/v）時凝膠化時間最短（～290 s）。

將超分子水凝膠進行動態(tài)頻率掃描，可得到α-CD的濃度對凝膠強度的影響規(guī)律。從圖7D可以看出，3個凝膠樣品均是彈性凝膠，剪切速率為0.1～100 rad/s，且G'＞G''。特別是C1凝膠（在100 rad/s時，G'=1 483 Pa）具有最強的彈性，比C2凝膠（在100 rad/s時，G'=1 085 Pa）高1.4倍，比C3凝膠（在100 rad/s時，G'=299 Pa）高4.9倍。如圖7E（25 ℃）和圖8（37 ℃）所示為不同α-CD濃度的超分子水凝膠的剪切粘度隨剪切速率的變化曲線。結(jié)果顯示，3個凝膠樣品均表現(xiàn)出類似非牛頓流體的剪切變稀的性質(zhì)，在較低的剪切速率下表現(xiàn)出較高的粘度：當剪切速率由0/s增加到10/s時，粘度由4 674、4 388、471 Pas逐漸降到0。

圖7 超分子水凝膠的流變性質(zhì)

圖8 37 ℃條件下不同α-CD濃度剪切粘度隨剪切速率的變化曲線

2.3.4 體外釋放實驗：圖9A所示為不同α-CD濃度的超分子水凝膠對PTX藥物的體外釋放行為?？梢钥闯?個凝膠體系對PTX均有良好的緩釋效果，且釋放過程可持續(xù)72 h以上。所有樣品在前24 h均無出現(xiàn)明顯的暴釋現(xiàn)象，隨后轉(zhuǎn)入持續(xù)性的釋放過程，最終水凝膠完全溶解消失，且C4、C5和C6水凝膠的累積釋放量分別為76.3%、89.1%和99.7%。從數(shù)據(jù)來看，C4、C5和C6水凝膠累積釋放量之間的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實驗結(jié)果表明PTX的釋放速率可以通過α-CD的濃度進行調(diào)節(jié)。

2.3.5 體外細胞實驗：圖9B所示為超分子水凝膠在不同濃度下釋放出的PTX對A549肺癌細胞的抑制效果。結(jié)果顯示，對癌細胞的毒性依賴于PTX的濃度，PTX膠束和PTX水凝膠分別與游離的PTX比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實驗結(jié)果表明PTX膠束和PTX水凝膠延緩了PTX的釋放速度，延長PTX抗腫瘤作用時間。

3 討論

高分子量聚乙二醇（PEG，相對分子質(zhì)量＞10 kDa）和聚丙二醇與環(huán)氧乙烷的加聚物形成的嵌段共聚物可以與α-CD形成可注射超分子水凝膠，而低分子量PEG會與α-CD形成共沉淀[4，12]。有研究表明，α-CD與水溶液狀態(tài)的PEG嵌段共聚物可以通過主客體相互作用以及疏水作用形成水凝膠[13-16]?；诖耍诒狙芯恐?，我們利用MPEG5000-PCL5000與α-CD構(gòu)建了一類新型的能負載抗腫瘤藥物的超分子水凝膠。研究表明，MPEG5000-PCL5000在凝膠化的過程中占據(jù)了不可或缺的地位。首先，MPEG5000-PCL5000具有的兩親性使得其自身就能形成能負載疏水性藥物的膠束。其次，MPEG5000-PCL5000中具有疏水性的PCL鏈段的自聚集對凝膠的形成有誘導(dǎo)作用，且使得超分子水凝膠的性質(zhì)更加穩(wěn)定。表1的數(shù)據(jù)表明，凝膠化時間可通過α-CD濃度調(diào)節(jié)。體系中α-CD的濃度越高，越能促進MPEG5000-PCL5000中具有疏水性的PCL鏈段的自聚集，因此越能縮短凝膠化時間，且使得超分子水凝膠的性質(zhì)更加穩(wěn)定[15]。LIU等[14]研究也發(fā)現(xiàn)，以α-CD為主體的水凝膠的凝膠化時間及性質(zhì)可以通過組分等因素調(diào)控。

圖9 超分子水凝膠在不同濃度下釋放出的PTX對A549肺癌細胞的抑制效果

初步的研究表明，在以CD為主體構(gòu)建的超分子水凝膠中，被部分包含的PEG或者PEO鏈相互聚集，通過α-CD分子之間的氫鍵作用形成微晶區(qū)[11，17]。如圖5所示的XRD圖譜證實了凝膠結(jié)構(gòu)中這種超分子結(jié)構(gòu)的形成，凝膠樣品在2θ=19.8°處出現(xiàn)了新峰。因此MPEG5000-PCL5000與α-CD發(fā)生的主客體包合作用是形成超分子水凝膠的主要驅(qū)動力。圖6所示的形態(tài)學的觀察表明超分子水凝膠是一個多孔的結(jié)構(gòu)，且孔徑大小為100～150 μm。并且PTX的負載對其整體結(jié)構(gòu)的影響并不大。

超分子水凝膠流變性質(zhì)的研究對于凝膠形成（藥物負載）及藥物釋放（注射）過程中膠體結(jié)構(gòu)改變的研究具有十分重要的意義。圖7A-C所示為α-CD與含PTX的MPEG5000-PCL5000通過主客體相互作用形成的超分子水凝膠的動態(tài)應(yīng)變掃描曲線。從圖中可以看出，隨著α-CD濃度的增加，體系的凝膠化時間明顯縮短。該實驗結(jié)果與瓶倒轉(zhuǎn)法實驗所得到的結(jié)果是一致的。但是，由于在瓶倒轉(zhuǎn)法實驗中需要更多的鉸鏈以及更大的凝膠強度，因此，利用流變實驗測得的凝膠化時間要比利用瓶倒轉(zhuǎn)法測得的時間短[5，11]。圖7E所示為不同α-CD和MPEG5000-PCL5000濃度的超分子水凝膠的模量隨頻率的變化曲線。可以看出，凝膠的彈性模量基本不隨頻率變化，表現(xiàn)出一種“類固體”的性質(zhì)。隨著剪切的推進，由于α-CD和MPEG5000-PCL5000主客體之間包合作用的破壞，從而導(dǎo)致凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞，凝膠發(fā)生流動。ZHANG等[7]的研究結(jié)果表明超分子水凝膠表現(xiàn)出類似非牛頓流體的剪切變稀的性質(zhì)。

為了進一步研究本課題所制備的超分子水凝膠對藥物的緩釋作用，我們選擇了抗癌藥物PTX。圖9A所示，α-CD的濃度會對藥物的釋放速率產(chǎn)生極大的影響。由于C6水凝膠的強度比C4和C5水凝膠小，導(dǎo)致了C6水凝膠對PTX的釋放要比C4和C5更快。由于C6水凝膠對PTX的釋放集中在前24 h，因此我們推測水凝膠的凝膠降解（溶蝕）是其主要的釋放機理。同理，由于C4和C5水凝膠的強度較大，因此藥物的釋放過程可以持續(xù)72 h。因此，我們推測C4和C5水凝膠對藥物的釋放是擴散與凝膠降解（溶蝕）共同作用的結(jié)果。這些實驗結(jié)果表明，其藥物釋放的行為可通過α-CD的濃度來調(diào)控。

作為通用的抗癌藥物，PTX具有抑制腫瘤細胞并促進腫瘤細胞凋亡的作用，因此可通過研究超分子水凝膠對A549肺癌細胞的抑制效果來評價其藥效。圖9B所示為本研究所制備的負載PTX超分子水凝膠對A549肺癌細胞的抑制效果。結(jié)果顯示，負載PTX超分子水凝膠與PTX膠束具有同等的抗腫瘤效果，且抗腫瘤活性要優(yōu)于游離的PTX。相類似的實驗結(jié)果也在ZHU等[13]的研究中得到佐證，其研究結(jié)果表明，超分子水凝膠對順鉑的釋放是一個持續(xù)性的過程。

綜上所述，本研究制備了負載抗腫瘤藥物PTX的可注射超分子水凝膠。XRD實驗表明，該超分子水凝膠主要是通過MPEG5000-PCL5000的MPEG部分與α-CD的主客體相互作用。因此，可以通過處方組分濃度的改變，調(diào)整凝膠化時間、凝膠強度、流變性質(zhì)等參數(shù)，制備個性化的載藥超分子水凝膠。

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