張輝，孫嘉利，陳澤新，武垚森，林焱

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 骨科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）又稱退行性關(guān)節(jié)炎，往往被認(rèn)為是一種與多種因素相關(guān)、引起關(guān)節(jié)軟骨退化損傷、關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生的慢性退行性病變。但是OA的具體分子機(jī)制目前尚不清楚。研究[1-2]表明，OA的發(fā)生及進(jìn)展與軟骨細(xì)胞的衰老及軟骨退變密切相關(guān)，通過抑制細(xì)胞衰老可延緩OA的發(fā)生。因此，對延緩軟骨細(xì)胞衰老的研究是進(jìn)一步了解OA發(fā)生的具體機(jī)制及提供預(yù)防和治療OA的新思路的重要途徑及方向之一。

Sirt6是一種具有NAD+依賴的組蛋白去乙?；福鳛镾irtuins家族的一員，Sirt6的生物學(xué)效應(yīng)涉及延緩衰老、抑制炎癥、穩(wěn)定基因組等功能。有研究表明Sirt6可明顯抑制骨骺的發(fā)育[3]。但目前Sirt6對軟骨細(xì)胞功能的影響尚不明確。本研究通過體外實驗研究Sirt6與軟骨細(xì)胞衰老及細(xì)胞功能退變的關(guān)系，旨在驗證Sirt6對軟骨細(xì)胞衰老的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供的清潔級2周齡雄性SD大鼠，動物使用許可證號：SYXK（浙）2015-0009。胰蛋白酶（美國Hyclone公司），青鏈霉素（美國Gibco公司），II型膠原酶（美國Hyclone公司），胎牛血清（美國Gibco公司），F(xiàn)12培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）染色試劑盒（南京碧云天生物技術(shù)公司），質(zhì)粒抽提試劑盒（德國Qiagen公司），shSirt6質(zhì)粒（上海吉瑪公司），Sirt6質(zhì)粒、Sirt6-GFP質(zhì)粒和LC3-Cherry質(zhì)粒（由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉偉教授惠贈），兔多克隆抗體Anti-Sirt6（美國Abcam公司），兔抗兔多克隆抗體LC-3（美國Celt Signal-ing Technology公司），3-甲基腺嘌呤（3-methylad-enine，3-MA）（美國Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)：將分離得到的軟骨切成0.3～0.5 mm組織塊，含雙抗PBS液沖洗3遍，加入0.25%胰蛋白酶在37 ℃消化2 h后終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入0.2% II型膠原酶在37 ℃溫箱消化過夜，終止消化后200目濾網(wǎng)過濾，收集濾液，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入含20%胎牛血清、雙抗的F12培養(yǎng)基，將細(xì)胞均勻接種于培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行原代培養(yǎng)，待培養(yǎng)皿底面細(xì)胞長滿90%左右后，按照常規(guī)方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 β-gal染色：取六孔板培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，吸除培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，在培養(yǎng)皿中加入1 mL戊二醛，室溫固定15 min，吸除細(xì)胞固定液后，用PBS洗滌3次后，加入1 mL染色工作液（按試劑盒配方配制），37 ℃孵育過夜，普通顯微鏡下觀察染色效果。

1.2.3 Western blot：取六孔板中培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞置于冰上，4 ℃ PBS洗滌3次后加細(xì)胞裂解液（RIPA），反復(fù)吹打細(xì)胞后，吸取細(xì)胞裂解液置于EP管中，冰上裂解30 min，12 000 r/min 4 ℃離心15 min，吸取上清，BCA法檢測蛋白濃度，加蛋白上樣緩沖液后95 ℃煮沸5 min，保存于-20 ℃冰箱。提取軟骨細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移法將蛋白印跡轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉。一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，每次10 min，二抗室溫避光孵育1 h，TBST洗3次，使用Odyssey熒光掃描系統(tǒng)，選擇適當(dāng)?shù)膾呙鑿?qiáng)度，對目的條帶進(jìn)行分析。

1.2.4 慢病毒介導(dǎo)Sirt6轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞：將軟骨細(xì)胞接種于六孔板上，隨機(jī)分為慢病毒空載體轉(zhuǎn)染（空白）組、Sirt6轉(zhuǎn)染（過表達(dá)Sirt6）組和shSirt6轉(zhuǎn)染（敲低Sirt6）組。六孔板中軟骨細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%時，更換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h。取病毒液在冰上融解，使用無血清培養(yǎng)液按MOI值=200稀釋，加入終濃度為8 μg/mL的聚凝胺，混勻。敲低Sirt6組及過表達(dá)Sirt6組分別加入shSirt6陽性病毒液和Sirt6陽性病毒液，空白組加入陰性病毒液，培養(yǎng)箱中孵育12 h后更換完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，72 h后收細(xì)胞進(jìn)行下一步實驗。

1.2.5 qPCR檢測：用六孔板鋪板、轉(zhuǎn)染48 h后，分別使用對照溶液PBS和自噬抑制劑3-MA（10 μmol/L）處理24 h，總RNA的提取參考Trizol試劑盒使用說明書，整個提取處于無RNAase的環(huán)境下。引物設(shè)計見表1，通過一步法qPCR試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行擴(kuò)增。 引物分別加入10 μL qPCR反應(yīng)體系中，反應(yīng)條件為94 ℃變性45 s，59 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸60 s，共40個循環(huán)。qPCR反應(yīng)采用CFX96 TouchTMqPCR檢測系統(tǒng)，觀察二型膠原（Collagen-II）、蛋白聚糖（Aggrecan）、金屬基質(zhì)蛋白酶-13（metal matrix protease-13，MMP-13）及ADAMTS-5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5）基因在過表達(dá)Sirt6組和過表達(dá)Sirt6+3-MA組軟骨細(xì)胞之間的表達(dá)差異，實驗重復(fù)3次。

表1 引物序列

1.2.6 免疫熒光：取對數(shù)生長期的軟骨細(xì)胞重懸后加入含玻璃片的六孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS輕輕漂洗3次，10% FCS/PBS室溫封閉20 min，室溫孵育對應(yīng)的含0.1% Saponin的一抗（用10% FCS/PBS配置）2 h或4 ℃過夜，PBS漂洗3次后，室溫避光孵育對應(yīng)的含0.1% Saponin的熒光二抗1 h。PBS漂洗4次，封片劑封片。封好的玻片置于4 ℃保存。激光共聚焦圖像采集：所有圖像由Zeiss LSM510Meta激光共聚焦顯微鏡采集。采集過程使用60×、NA值1.4的物鏡在Multitrack模式下進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次。計量資料以±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗及單因素方差分析進(jìn)行檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞培養(yǎng) 體外連續(xù)培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞體外連續(xù)傳代至第20代時，軟骨細(xì)胞出現(xiàn)衰老現(xiàn)象（見圖1A-C）。使用β-gal染色方法檢測軟骨細(xì)胞衰老結(jié)果示：β-gal染色陽性的細(xì)胞隨著傳代次數(shù)的增加而增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1D。取第2、第10及第20代軟骨細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測Sirt6蛋白及P16蛋白表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)Sirt6蛋白的表達(dá)量逐漸減少，而P16蛋白的表達(dá)量逐漸增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1E-G。

圖1 不同代數(shù)軟骨細(xì)胞比較

2.2 慢病毒介導(dǎo)Sirt6轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞 敲低Sirt6組的軟骨細(xì)胞在傳代到第10代時出現(xiàn)明顯的衰老征象（見圖2A-B），且β-gal染色顯示陽性比例明顯高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見圖2C）。取空白組及敲低Sirt6組軟骨細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測Sirt6蛋白及P16蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Sirt6蛋白的表達(dá)量在敲低Sirt6組明顯減少，P16蛋白的表達(dá)量在敲低Sirt6組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2D-F。

圖2 敲低Sirt6組和空白組的第10代軟骨細(xì)胞傳代比較

2.3 軟骨細(xì)胞中過表達(dá)Sirt6 過表達(dá)Sirt6組的軟骨細(xì)胞的衰老與空白組比明顯延緩（見圖3A-B），最大傳代次數(shù)可達(dá)30代；第15代細(xì)胞進(jìn)行β-gal染色，比較陽性細(xì)胞比例，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Sirt6組的軟骨細(xì)胞β-gal染色陽性細(xì)胞與空白組比較明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3C。取空白組及過表達(dá)Sirt6組軟骨細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測Sirt6蛋白及P16蛋白表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)Sirt6蛋白的表達(dá)量在過表達(dá)Sirt6組明顯增多，P16蛋白的表達(dá)量在過表達(dá)Sirt6組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），圖3D-F。

圖3 過表達(dá)Sirt6組和空白組的第15代軟骨細(xì)胞傳代比較

2.4 Sirt6促進(jìn)軟骨細(xì)胞自噬發(fā)生 軟骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)入Sirt6-GFP、LC3-Cherry質(zhì)粒，免疫熒光觀察細(xì)胞中自噬泡（LC3），發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Sirt6組的軟骨細(xì)胞中自噬泡數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖4A-D。在軟骨細(xì)胞中過表達(dá)Sirt6，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測LC3-II/LC3-I的比例，過表達(dá)Sirt6后細(xì)胞中LC3-II/LC3-I比例顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖4E。

圖4 軟骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)入Sirt6-GFP、LC3-Cherry質(zhì)粒后免疫熒光觀察細(xì)胞中自噬泡

2.5 自噬抑制劑抑制Sirt6對軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用 在未轉(zhuǎn)染Sirt6慢病毒的原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入對照溶液PBS（空白組）和自噬抑制劑3-MA（3-MA組），連續(xù)傳代培養(yǎng)，結(jié)果示3-MA組軟骨細(xì)胞在第10代時出現(xiàn)明顯的衰老征象，比較2組中第10代軟骨細(xì)胞中β-gal染色的陽性率及對應(yīng)軟骨細(xì)胞功能變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3-MA組的β-gal染色的陽性率明顯高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5A-C；提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測P16蛋白、Sirt6蛋白及LC3-II/LC3-I的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3-MA組細(xì)胞中P16蛋白表達(dá)量明顯增多，而Sirt6蛋白表達(dá)量減少，且3-MA組中LC3-II/LC3-I比例顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5D-G；qPCR檢測發(fā)現(xiàn)3-MA組軟骨細(xì)胞Collagen-II、Aggrecan等mRNA的表達(dá)量明顯低于空白組（見圖5H-I），而MMP-13、ADAMTS-5 mRNA表達(dá)量明顯高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5J-K。

轉(zhuǎn)染Sirt6慢病毒的原代軟骨細(xì)胞分別在其培養(yǎng)基中加入自噬抑制劑3-MA（過表達(dá)+3-MA組）或?qū)φ杖芤篜BS（空白組），連續(xù)傳代培養(yǎng)，比較第15代軟骨細(xì)胞中β-gal染色的陽性率及對應(yīng)軟骨細(xì)胞功能變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：過表達(dá)組與空白組的β-gal染色的陽性率結(jié)果同前（見圖6A-B），同時，過表達(dá)+3-MA組的β-gal染色的陽性率明顯高于過表達(dá)組（P＜0.05），見圖6B-D。提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測P16蛋白、Sirt6蛋白及LC3-II/LC3-I的比例，過表達(dá)+3-MA組與過表達(dá)組相比，P16蛋白表達(dá)量顯著增多，而Sirt6蛋白表達(dá)量減少，且過表達(dá)+3-MA組中LC3-II/LC3-I比例顯著降低（P＜0.05），見圖6E-H。qPCR檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)+3-MA組軟骨細(xì)胞Collagen-II、Aggrecan等mRNA的表達(dá)量明顯低于過表達(dá)組（見圖6I-J），而MMP-13、ADAMTS-5 mRNA表達(dá)量明顯高于過表達(dá)組（P＜0.05），見圖6K-L。

3 討論

OA是最常見的關(guān)節(jié)疾病，其主要以關(guān)節(jié)表面軟骨的塌陷、壞死為特征[4]。流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，在我國人群中，OA的患病率約為4%，而60歲以上者膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率則高達(dá)42.8%[5]。軟骨細(xì)胞的功能紊亂往往被認(rèn)為是OA發(fā)病的關(guān)鍵原因。影響軟骨細(xì)胞功能的因素眾多，目前認(rèn)為衰老、炎癥、遺傳因素、代謝因素、免疫學(xué)因素等是軟骨細(xì)胞功能紊亂的主要原因，但其具體的分子機(jī)制尚未完全闡明，研究上述影響因素對OA發(fā)生的影響，將為我們提供OA治療的新線索。

軟骨細(xì)胞衰老是OA發(fā)生的重要原因。PRICE等[6]對不同退變程度的軟骨組織進(jìn)行β-gal染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OA的軟骨組織中β-gal染色陽性的細(xì)胞數(shù)明顯增多，并且陽性染色的細(xì)胞比例隨著關(guān)節(jié)退變程度的加重逐漸增多，分離培養(yǎng)體外原代軟骨細(xì)胞也得到了相同的結(jié)論。另外，LOESER[7]的研究也發(fā)現(xiàn)，除細(xì)胞凋亡，軟骨細(xì)胞衰老也與OA的發(fā)生密切相關(guān)。ZHOU等[8]研究發(fā)現(xiàn)，P16的表達(dá)在OA軟骨細(xì)胞中明顯增加，隨著敲低軟骨細(xì)胞中P16的表達(dá)，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞衰老得到明顯改善，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中特異性基因和修復(fù)能力有所上升。由此可見，OA的發(fā)生可以通過抑制軟骨細(xì)胞的衰老進(jìn)行調(diào)控。

圖5 自噬抑制劑抑制Sirt6對軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用

圖6 過表達(dá)組、過表達(dá)+3-MA組及空白組的第15代軟骨細(xì)胞比較

Sirtuins（Sirt1-Sirt7）蛋白家族作為一類NAD+依賴的組蛋白去乙?；讣癆DP核糖基轉(zhuǎn)移酶，參與了機(jī)體的應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及壽命調(diào)節(jié)等生理病理過程。Sirt6是Sirtuins蛋白家族的一個重要角色，在抗衰老領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注。MOSTOSLAVSKY等[9]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將分別敲除小鼠的Sirt1-Sirt7基因后，結(jié)果只有Sirt6基因缺陷的小鼠出現(xiàn)了明顯的衰老變現(xiàn)，并且出現(xiàn)了骨密度降低、皮下脂肪減少、淋巴細(xì)胞減少等早衰癥狀。KANFI等[10]的研究表明，過表達(dá)Sirt6的轉(zhuǎn)基因雄性小鼠與野生型雄性小鼠比較具有明顯的壽命延長現(xiàn)象，過表達(dá)Sirt6雄性小鼠血清中的胰島素生長因子-1水平明顯降低，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1升高，IGF-1信號通路主要組分磷酸化水平改變。MICHISHITA等[11]也發(fā)現(xiàn)，在人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞WI-38中敲低Sirt6可使其復(fù)制代齡縮短10代，衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶（SA-β-GAL）活性上升。此外，在體外細(xì)胞實驗中也發(fā)現(xiàn)Sirt6可以明顯延緩血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老[12]。本研究通過對大鼠原代軟骨細(xì)胞的傳代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞中Sirt6的表達(dá)量隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增多而逐漸降低，并且通過慢病毒在軟骨細(xì)胞中敲低Sirt6及過表達(dá)Sirt6后，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Sirt6可以明顯延緩軟骨細(xì)胞的衰老，同時，在敲低Sirt6后的軟骨細(xì)胞中，細(xì)胞出現(xiàn)提前衰老。

自噬是通過溶酶體依賴性降解途徑，影響細(xì)胞內(nèi)長壽蛋白和受損傷細(xì)胞器的降解，與機(jī)體的多種疾病密切相關(guān)。在生理或病理狀態(tài)下，細(xì)胞可以通過溶酶體來清除細(xì)胞內(nèi)過多或異常的蛋白質(zhì)、受損的細(xì)胞器，從而維持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定和代謝平衡；在各種不利的應(yīng)激情況下，細(xì)胞亦可通過提升自噬水平來應(yīng)對外界應(yīng)激。與此同時，自噬是一種維持細(xì)胞正常功能的重要機(jī)制，參與了細(xì)胞衰老的調(diào)控。細(xì)胞自噬活性隨年齡增加而下降，長期慢性抑制自噬性蛋白降解會加速衰老，而提高細(xì)胞內(nèi)的自噬水平有助于延長壽命[13]。自噬目前被認(rèn)為是關(guān)節(jié)軟骨的一個重要保護(hù)機(jī)制[14-15]。在OA的后期軟骨細(xì)胞的自噬水平明顯降低；使用自噬激活劑如雷帕霉素、氯化鋰等能明顯抑制軟骨的退變，可延緩OA的發(fā)生[16-18]。同時在體外實驗中，自噬可以抑制軟骨細(xì)胞的凋亡，并且可以阻止IL-1β引起的細(xì)胞外基質(zhì)的降解[19]。Sirt1與Sirt6是Sinuins蛋白家族的同源物。多項研究已證實Sirt1與OA的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[20-23]。Sirt1在OA軟骨組織的低表達(dá)與軟骨細(xì)胞自噬水平正相關(guān)，通過上調(diào)Sirt1表達(dá)水平，可顯著上調(diào)OA軟骨細(xì)胞自噬水平[24]。但是Sirt6抑制軟骨細(xì)胞衰老與自噬的關(guān)系尚未見報道。本研究通過軟骨細(xì)胞中過表達(dá)Sirt6，發(fā)現(xiàn)Sirt6可能促進(jìn)軟骨細(xì)胞自噬發(fā)生，同時在使用自噬抑制劑后可以明顯抑制Sirt6對軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。盡管本研究明確Sirt6抑制軟骨細(xì)胞的衰老和促進(jìn)自噬相關(guān)，但是，Sirt6調(diào)控軟骨細(xì)胞自噬的具體分子機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究以明確。

綜上所述，本研究通過體外實驗證實Sirt6在軟骨細(xì)胞衰老中扮演著重要角色，提高Sirt6的活性可以抑制軟骨細(xì)胞的衰老；同時發(fā)現(xiàn)，Sirt6可以通過上調(diào)軟骨細(xì)胞的自噬水平抑制其衰老。本研究為OA的研究找到了新的分子靶點(diǎn)，為治療OA提供了新的研究方向。

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