洪逸蓮，顧雪疆，徐靜，林怡，斯琪雅

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科，浙江 溫州 325015）

脂肪肝指由于各種因素導(dǎo)致的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)度積聚的病變，與肥胖等代謝性疾病密切相關(guān)，被認(rèn)為是代謝綜合征的肝表現(xiàn)[1-3]。人參為中國(guó)傳統(tǒng)中藥，被廣泛用于治療各種代謝性疾病，如高血糖、高血脂和慢性肝臟疾病[4]。人參皂苷（ginsenoside）是人參的主要有效成分之一。研究證明人參及其有效成分人參皂苷具有降血脂、抗肝損傷等作用[5]。人參皂苷Rg3、Rg5、Rb1均可以改善肝臟脂肪變性[6-9]。最新研究報(bào)道人參皂苷Rb2能通過(guò)調(diào)節(jié)自噬信號(hào)通路，阻止肝臟脂質(zhì)積累，改善糖耐量[10]。

目前，關(guān)于人參皂苷Rb2對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝的影響研究較少。本研究通過(guò)建立高脂性脂肪肝小鼠模型，并用人參皂苷Rb2處理，探討人參皂苷Rb2對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝的作用及其機(jī)制，以期進(jìn)一步研究人參皂苷Rb2的藥用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡雄性C57BL/6J小鼠18只購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005]，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)動(dòng)物房，自由攝食與飲水，溫度（22±3）℃，濕度50%±5%，每天光照與黑夜時(shí)間各為12 h。

1.2 試劑和儀器 人參皂苷Rb2購(gòu)自上海源葉生物有限公司，10% kcal對(duì)照飼料和60% kcal高脂飼料購(gòu)自江蘇美迪森公司，兔抗小鼠過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARα）抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自立陶宛MBI公司，熒光定量PCR試劑盒、熒光定量PCR儀（IQ5）均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 高脂性脂肪肝模型制備及給藥 C57BL/6J雄性小鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、高脂模型組和人參皂苷Rb2組，普通飼料適應(yīng)1周，正常對(duì)照組予10%kcal對(duì)照飼料，其余2組予60% kcal高脂飼料喂食8周，稱體質(zhì)量。造模結(jié)束后，人參皂苷Rb2組予40 mg·kg-1·d-1人參皂苷Rb2腹腔注射，時(shí)間為早上9：00-10：00，連續(xù)注射10 d，正常對(duì)照組和高脂模型組予PBS相應(yīng)處理。

1.4 肝組織標(biāo)本制備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食12 h后，用水合氯醛麻醉處死小鼠，取肝組織稱重，部分肝組織以4%多聚甲醛溶液固定，用于普通病理染色；其余肝組織液氮速凍，-80 ℃保存。

1.5 肝質(zhì)量系數(shù)計(jì)算 計(jì)算肝質(zhì)量系數(shù)：肝質(zhì)量系數(shù)=肝臟質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（100 g）。

1.6 肝組織形態(tài)學(xué)檢查 對(duì)4%多聚甲醛溶液固定的肝組織進(jìn)行常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色后于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)檢查。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá) 檢測(cè)脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）、脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatory element binding protein，SREBP）-1c、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（carnitine palmitoyl transferase，CPT）-1、膽固醇7α羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）、PPARα、二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（diacylgycerol acyltransferase，DGAT）基因表達(dá)。利用Trizol法提取RNA。取2 μg RNA，按Revertra First Strand cDNA Synthesis kit說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，然后以其為模板加入引物和SYBR，按說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。實(shí)驗(yàn)所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，具體序列如表1所示。

表1 引物序列

1.8 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 取20 mg組織樣本，加入200 uL蛋白裂解液（蛋白裂解液:PMSF為100:1），勻漿機(jī)研磨均勻。低溫離心15 000 r/min，20 min，將無(wú)色透明上清液移至新的EP管中，BCA法測(cè)蛋白濃度，后加入適量loading buffer，100 ℃變性5 min后-20 ℃低溫保存。SDS-PAGE膠制備10%的分離膠和5%的濃縮膠。電泳槽內(nèi)加入一定量的電泳液，SDS-PAGE膠固定好后放入電泳槽，每孔加入等量蛋白；80 V恒壓30 min后，加壓至100～120 V恒壓，待目的蛋白至電泳夾底部中下時(shí)，停止電泳，低溫220 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h，5%牛奶封閉液4 ℃封閉過(guò)夜；將PPARα抗體與一抗稀釋液1:1 000配制成工作液，4 ℃水平搖床中孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，每次10 min，山羊抗兔二抗室溫水平搖床中孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min；曝光。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料用±s表示，3組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝臟組織學(xué)觀察 光學(xué)顯微鏡下觀察，正常對(duì)照組肝細(xì)胞排列呈索狀，結(jié)構(gòu)正常；高脂模型組小鼠肝組織可見細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大小不等的脂肪空泡，呈脂肪變性；人參皂苷Rb2組與高脂模型組相比，脂肪空泡數(shù)目和體積明顯減少，脂肪變性程度減輕，見圖1。

圖1 3組小鼠肝臟HE染色（×40）

2.2 體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝質(zhì)量系數(shù) 高脂喂食明顯增加了小鼠的體質(zhì)量及肝質(zhì)量，人參皂苷Rb2腹腔注射后，小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量比高脂模型組分別降低了5.66%和12.97%，肝質(zhì)量系數(shù)亦明顯下降（均P＜0.05），見表2。

表2 3組體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝質(zhì)量系數(shù)（n=6， ±s）

表2 3組體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝質(zhì)量系數(shù)（n=6， ±s）

與正常對(duì)照組比：aP＜0.05；與高脂模型組比：bP＜0.05

組別 體質(zhì)量（g）肝質(zhì)量（g） 肝質(zhì)量系數(shù)正常對(duì)照組 25.000±3.360 1.211±0.275 4.844±0.561高脂模型組 35.320±3.293a1.542±0.236a4.366±0.381a人參皂苷Rb2組 33.050±2.831b1.301±0.181b3.936±0.309b

2.3 肝臟脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá) 與正常對(duì)照組相比，高脂模型組LPL、DGAT、SREBP-1c、FAS基因表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），CYP7A1、CPT-1表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）；與高脂模型組相比，人參皂苷Rb2組肝臟組織LPL、SREBP-1c、FAS基因表達(dá)量明顯下降（P＜0.05），DGAT未見明顯變化（P＞0.05），CYP7A1、CPT-1表達(dá)量明顯增加（P＜0.05），見表3。

2.4 肝臟PPARα信號(hào)通路的表達(dá) 本研究在基因水平和蛋白水平進(jìn)一步檢測(cè)了肝臟PPARα蛋白和基因的表達(dá)，結(jié)果顯示高脂模型組與正常對(duì)照組比較，PPARα表達(dá)明顯抑制，而人參皂苷Rb2可明顯增加肝臟PPARα的表達(dá)（見表4）。

表3 3組肝臟脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)（n=6， ±s）

表3 3組肝臟脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)（n=6， ±s）

與正常對(duì)照組比：aP＜0.05；與高脂模型組比：bP＜0.05

組別 LPL DGAT SREBP-1c FAS CYP7A1 CPT-1正常對(duì)照組 0.579±0.062 1.207±0.240 0.704±0.104 0.130±0.069 0.170±0.012 1.049±0.211高脂模型組 1.168±0.180a 1.396±0.427a 2.945±0.228a 0.897±0.129a 0.100±0.024a 0.728±0.234a人參皂苷Rb2組 0.958±0.292b 1.218±0.436 1.181±0.584b 0.267±0.211b 0.203±0.020b 1.091±0.214b

表4 3組PPARα表達(dá)變化（n=6， ±s）

表4 3組PPARα表達(dá)變化（n=6， ±s）

與正常對(duì)照組比：aP＜0.05；與高脂模型組比：bP＜0.05

組別 PPARα基因 PPARα蛋白正常對(duì)照組 1.407±0.170 0.485±0.072高脂模型組 0.599±0.088a 0.199±0.011a人參皂苷Rb2組 1.000±0.108b 0.383±0.052b

3 討論

高脂飲食干預(yù)是造成包括肥胖、脂肪肝、胰島素抵抗在內(nèi)的諸多代謝性疾病模型的成熟方式。長(zhǎng)期的高脂飲食能夠增加動(dòng)物模型的β細(xì)胞氧化，導(dǎo)致胰島素抵抗，造成甘油三酯（triglyceride，TG）異位積聚，增加非氧化脂肪酸的代謝、脂質(zhì)過(guò)氧化和脂質(zhì)凋亡[11]。本研究通過(guò)高脂飲食建立穩(wěn)定的高脂性脂肪肝模型，結(jié)果顯示，高脂模型小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量明顯增加，同時(shí)伴有肝臟脂肪變性、脂質(zhì)代謝障礙。

脂質(zhì)代謝是生物體內(nèi)能量代謝的重要方式，是指在各種酶的幫助下，體內(nèi)脂肪消化、吸收、合成、分解的過(guò)程。DGAT、FAS、SREBP-1c是脂肪合成的關(guān)鍵酶[12-13]，其表達(dá)增加可以導(dǎo)致肝內(nèi)TG沉積。LPL在TG代謝中起著關(guān)鍵作用，可將極低密度脂蛋白和乳糜微粒中的TG裂解成甘油和脂肪酸，使極低密度脂蛋白和乳糜微粒分解產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成高密度脂蛋白膽固醇[14]。CYP7A1是膽固醇轉(zhuǎn)化成膽汁酸的限速酶[15-16]，其表達(dá)上調(diào)將會(huì)降低血漿膽固醇濃度。CPT-1是脂肪酸氧化限速酶[17]，在β氧化過(guò)程當(dāng)中，催化長(zhǎng)鏈?；o酶A轉(zhuǎn)化為長(zhǎng)鏈酰基肉堿。本研究顯示，高脂飲食增加SREBP-lc、FAS、LPL、DGAT基因表達(dá)，抑制CYP7A1、CPT-1基因表達(dá)，而人參皂苷Rb2可以顯著下調(diào)SREBP-lc、FAS、LPL基因表達(dá)，上調(diào)CYP7A1、CPT-1基因表達(dá)，促進(jìn)肝臟脂肪分解，抑制脂肪合成。

PPARα是調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝和線粒體、過(guò)氧化酶體及微粒體脂肪酸氧化的關(guān)鍵因子，可在多個(gè)環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)游離脂肪酸及脂質(zhì)在肝臟的代謝，在脂肪肝的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[18-19]。PPARα還可以減輕炎癥反應(yīng)，改善肝臟氧化應(yīng)激，阻止肝組織損傷發(fā)生[20]。PPARα激動(dòng)劑可以明顯減少血漿TG含量，改善肝臟脂肪變性，增加胰島素敏感性[21-22]。本研究中，高脂模型組肝臟PPARα表達(dá)顯著下降，經(jīng)人參皂苷Rb2處理后，在基因和蛋白水平高脂小鼠肝臟PPARα均顯著改善，結(jié)果顯示人參皂苷Rb2可以逆轉(zhuǎn)高脂飲食導(dǎo)致的PPARα表達(dá)下降。

綜上所述，人參皂苷Rb2下調(diào)脂代謝相關(guān)基因FAS、LPL和SREBP-1c表達(dá)，上調(diào)CPT-1和CYP7A1表達(dá)，增加肝臟PPARα的表達(dá)，減少肝臟脂肪細(xì)胞TG和脂肪酸的合成，促進(jìn)脂肪酸過(guò)氧化，進(jìn)而發(fā)揮改善肝臟脂肪代謝，減少肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] BERNSTEIN D E. Nonalcoholic fatty liver disease: An expanding health care epidemic[J]. Clin Liver Dis, 2018, 22(1): 13-14.

[2] 婁林潔, 游艷婷, 馬柯, 等. 香砂六君丸對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝臟線粒體的影響[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 47(11): 796-800.

[3] MUSSO G, CASSADER M, GAMBINO R. Non-alcoholic steatohepatitis: emerging molecular targets and therapeutic strategies[J]. Nat Rev Drug Discov, 2016, 15(4): 249-274.

[4] LI Z, JI G E. Ginseng and obesity[J]. J Ginseng Res, 2018,42(1): 1-8.

[5] PARK T Y, HONG M, SUNG H, et al. Effect of Korean Red Ginseng in chronic liver disease[J]. J Ginseng Res, 2017,41(4): 450-455.

[6] LEE J B, YOON S J, LEE S H, et al. Ginsenoside Rg3 ameliorated HFD-induced hepatic steatosis through downregulation of STAT5-PPARgamma[J]. J Endocrinol, 2017, 235(3):223-235.

[7] XIAO N, LOU M D, LU Y T, et al. Ginsenoside Rg5 attenuates hepatic glucagon response via suppression of succinateassociated HIF-1alpha induction in HFD-fed mice[J]. Diabetologia, 2017, 60(6): 1084-1093.

[8] YU X, YE L, ZHANG H, et al. Ginsenoside Rb1 ameliorates liver fat accumulation by upregulating perilipin expression in adipose tissue of db/db obese mice[J]. J Ginseng Res,2015, 39(3): 199-205.

[9] SHEN L, XIONG Y, WANG D Q, et al. Ginsenoside Rb1 reduces fatty liver by activating AMP-activated protein kinase in obese rats[J]. J Lipid Res, 2013, 54(5): 1430-1438.

[10] HUANG Q, WANG T, YANG L, et al. Ginsenoside Rb2 alleviates hepatic lipid accumulation by restoring autophagy via induction of Sirt1 and activation of AMPK[J]. Int J Mol Sci, 2017, 18(5): 1063-1064.

[11] UNGER R H, ORCI L. Diseases of liporegulation: new perspective on obesity and related disorders[J]. FASEB J, 2001,15(2): 312-321.

[12] BASANTANI M K, SITNICK M T, CAI L, et al. Pnpla3/Adiponutrin deficiency in mice does not contribute to fatty liver disease or metabolic syndrome[J]. J Lipid Res, 2011,52(2): 318-329.

[13] ARENDT B M, COMELLI E M, MA D W, et al. Altered hepatic gene expression in nonalcoholic fatty liver disease is associated with lower hepatic n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acids[J]. Hepatology, 2015, 61(5): 1565-1578.

[14] YAN D, LEHTO M, RASILAINEN L, et al. Oxysterol binding protein induces upregulation of SREBP-1c and enhances hepatic lipogenesis[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2007,27(5): 1108-1114.

[15] ZHALDAK D A, MELEKHOVETS O K, ORLOVSKYI V F. CYP7A1 gene polymorphism and the characteristics of dyslipidemias in patients with nonalcoholic fatty liver disease concurrent with hypothyroidism[J]. Ter Arkh, 2017, 89(10): 62-65.

[16] LI Q, HONG J, WU J, et al. The role of common variants of ABCB1 and CYP7A1 genes in serum lipid levels and lipid-lowering efficacy of statin treatment: a meta-analysis[J]. J Clin Lipidol, 2014, 8(6): 618-629.

[17] KIM S M, LEE B, AN H J, et al. Novel PPARalpha agonist MHY553 alleviates hepatic steatosis by increasing fatty acid oxidation and decreasing inflammation during aging[J]. Oncotarget, 2017, 8(28): 46273-46285.

[18] EVANS R M, BARISH G D, WANG Y X. PPARs and the complex journey to obesity[J]. Nat Med, 2004, 10(4): 355-361.

[19] ZHAO N J, LIAO M J, WU J J, et al. Curcumin suppresses Notch1 signaling: Improvements in fatty liver and insulin resistance in rats[J]. Mol Med Rep, 2018, 17(1): 819-826.

[20] STANDAGE S W, BENNION B G, KNOWLES T O, et al.PPARalpha augments heart function and cardiac fatty acid oxidation in early experimental polymicrobial sepsis[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2017, 312(2): H239-H249.

[21] KIM H, HALUZIK M, ASGHAR Z, et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment in a transgenic model of type 2 diabetes reverses the lipotoxic state and improves glucose homeostasis[J]. Diabetes, 2003,52(7): 1770-1778.

[22] CHOU C J, HALUZIK M, GREGORY C, et al. WY14, 643,a peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) agonist, improves hepatic and muscle steatosis and reverses insulin resistance in lipoatrophic A-ZIP/F-1 mice[J]. J Biol Chem, 2002, 277(27): 24484-24489.