鄭麗紅，劉翊，朱雪瓊

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325027）

宮頸癌在女性惡性腫瘤中的死亡率位居第三，尤其是晚期宮頸癌患者，其5年生存率僅為40%[1-2]。目前，對于晚期宮頸癌患者，順鉑是最有效的化療藥物，然而順鉑缺乏對宮頸癌的靶向功能[3-4]，因此，探索靶向治療宮頸癌的方法十分必要。

間充質(zhì)干細(xì)胞是成人非造血干細(xì)胞，廣泛存在于各種器官和組織的基質(zhì)[5]。研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞對許多類型的實體瘤具有趨向性，如肝癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤、骨髓瘤等[6-9]，可作為靶向治療的良好載體。也有研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞可作為載體細(xì)胞攜帶TRAIL、IL-21、IFN-β等因子靶向治療腫瘤[10-12]。本研究提取人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（human adipose tissue derived mesenchymal stem cell，hATMSC），并探討其對宮頸鱗癌細(xì)胞和腺癌細(xì)胞的趨化性，為將間充質(zhì)干細(xì)胞研發(fā)成為宮頸癌靶向治療載體提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 研究方案經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。皮下脂肪取自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院行剖宮產(chǎn)手術(shù)的產(chǎn)婦，均已簽署知情同意書。人宮頸鱗癌細(xì)胞SiHa、MS751、C33-A、CaSki及宮頸腺癌細(xì)胞Hela均購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫。分化培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；流式表型鑒定相關(guān)的CD90、CD44、CD105、HLAABC、CD34、CD45和HLA-DR抗體均購于美國BD公司。

1.2 hATMSC分離培養(yǎng) 無菌條件下取剖宮產(chǎn)手術(shù)患者的皮下脂肪組織1 cm×1 cm×2 cm，將脂肪組織與表面的結(jié)締組織包膜及血管相分離后，用含4%青鏈霉素的PBS洗3次，剪碎后加入0.075% I型膠原酶，于37 ℃水浴孵60 min。用含血清的培養(yǎng)基終止消化，細(xì)胞濾器過濾，離心，PBS洗2次。用低糖DMEM+10%胎牛血清+1%青鏈霉素重懸，接種到T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。48 h后首次換液。

1.3 hATMSC多向分化誘導(dǎo)及檢測 hATMSC以1×105/mL的密度接種于6孔板中，進(jìn)行多向分化誘導(dǎo)及檢測：①誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞：加入成骨分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)14 d，誘導(dǎo)完成后進(jìn)行堿性磷酸酶染色；②誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞：加入成脂分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)14 d，誘導(dǎo)完成后進(jìn)行油紅染色。

1.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測hATMSC表面標(biāo)志物 取生長良好的第3代間充質(zhì)干細(xì)胞，胰酶消化，用含2.5%胎牛血清的PBS封閉10 min，收集細(xì)胞，分別加入相應(yīng)抗體，4 ℃下避光孵育30 min，最后用200 μL PBS重懸后用流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 qRT-PCR檢測hATMSC中OCT-4 mRNA的表達(dá) 取第4～第6代hATMSC，用Trizol提取總RNA，取1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)總體積20 μL。OCT-4引物：上游5’-CGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCT-3’；下游5’-CAA GGGCCGCAGCTTACACATGTT-3’；GAPDH為內(nèi)參：上游5’-AAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3’；下游5’-GTCAAAGGTGGAGGA GTGG-3’。取1 μL cDNA，按照qRT-PCR試劑盒說明書操作，采用10 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共循環(huán)45次。成纖維細(xì)胞中OCT-4 mRNA的表達(dá)作為對照組。

1.6 Transwell實驗檢測hATMSC向5種宮頸癌細(xì)胞的趨化 分別將生長狀態(tài)良好的5種宮頸癌細(xì)胞按1×105/孔接種于Transwell下室，同時設(shè)置陰性對照組為不含腫瘤細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基。第2天，將腫瘤細(xì)胞換液為無血清的培養(yǎng)基。將生長狀態(tài)良好的hATMSC用無血清的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度，每孔2×104個細(xì)胞，加入Transwell上室，并將Transwell上室置入含腫瘤細(xì)胞和不含腫瘤細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基。放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后取出Transwell上室，結(jié)晶紫染色。顯微鏡下（×100）觀察向下室遷移的hATMSC數(shù)目。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理方法 數(shù)據(jù)采用Stats統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊的2組之間采用LSD法進(jìn)行比較，方差不齊的2組之間采用Dunnett’s法進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hATMSC的形態(tài)學(xué)觀察 原代培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，鏡下可見散在貼壁梭形細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)逐漸均一，排列呈魚群樣。約1周后細(xì)胞融合度至80%左右，此時進(jìn)行細(xì)胞傳代。第3代后的hATMSC均勻良好。第3～第10代的細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，均呈旋渦狀，見圖1。

2.2 hATMSC分化能力 用成骨、成脂培養(yǎng)基誘導(dǎo)14 d，堿性磷酸酶染色后看到成片的深棕色鈣沉積顆粒，油紅染色看到紅色脂滴，見圖2。

圖1 hATMSC形態(tài)學(xué)觀察（×100）

2.3 hATMSC表型鑒定結(jié)果 間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD90、CD44、CD105、HLA-ABC陽性率分別為（99.08±0.56）%、 （99.45±0.54）%、 （98.61±0.50）%和（97.45±4.28）%，而造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34和CD45的陽性表達(dá)率僅為（0.17±0.02）%、 （0.02±0.02）%，HLA-DR的陽性率為（0.02±0.02）%，提示間充質(zhì)表型陽性，而造血干細(xì)胞表型為陰性，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特點，見圖3。

2.4 qRT-PCR檢測hATMSC中OCT-4 mRNA的表達(dá) 采用qRT-PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，hATMSC中OCT-4 mRNA的表達(dá)為成纖維細(xì)胞的（698.12±11.23）倍，說明hATMSC中OCT-4呈高表達(dá)。

圖2 hATMSC分化能力鑒定（×100）

圖3 流式細(xì)胞技術(shù)鑒定hATMSC表型

2.5 hATMSC體外向?qū)m頸癌細(xì)胞的趨化 體外遷移實驗結(jié)果表明，在Transwell共培養(yǎng)體系下室為宮頸癌細(xì)胞SiHa、MS751、C33-A、CaSki、Hela和陰性對照組中，趨化至膜對側(cè)的hATMSC細(xì)胞數(shù)分別為145.0±3.6、123.4±2.3、181.1±4.7、95.7±6.4、106.5±8.2和17.0±2.6，宮頸癌細(xì)胞各組中hATMSC遷移數(shù)均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示hATMSC對宮頸鱗癌細(xì)胞和腺癌細(xì)胞均有明顯的趨化性，其中，C33-A細(xì)胞誘導(dǎo)hATMSC細(xì)胞遷移的能力最強，SiHa、MS751、Hela細(xì)胞次之，而CaSki細(xì)胞相對較弱。見圖4。

圖4 hATMSC對不同宮頸癌細(xì)胞的遷移能力

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞對多種實體瘤具有趨向性[6-9]，但對宮頸癌的趨向性研究卻鮮見報道。hATMSC具有以下優(yōu)點：脂肪組織來源廣泛、容易獲得；人體脂肪組織含量大；免疫原性低，可以通過MHC限制性，為體外移植創(chuàng)造條件，利于后續(xù)的進(jìn)一步研究。因此，本研究分離、原代培養(yǎng)和鑒定hATMSC，并探討其對不同宮頸癌細(xì)胞的趨化性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hATMSC對宮頸鱗癌細(xì)胞和腺癌細(xì)胞均有明顯的趨化性。經(jīng)比較分析，C33-A細(xì)胞誘導(dǎo)hATMSC的遷移能力最強，SiHa細(xì)胞、MS751細(xì)胞、Hela細(xì)胞次之，而CaSki細(xì)胞相對較弱，提示hATMSC可能可作為載體靶向治療宮頸鱗癌和腺癌。在后續(xù)的在體動物實驗研究中，可以選擇C33-A細(xì)胞來構(gòu)建原位的宮頸癌裸鼠模型，進(jìn)一步研究hATMSC作為藥物載體，對宮頸癌細(xì)胞的靶向作用。

盡管本研究結(jié)果證實了hATMSC對宮頸癌細(xì)胞具有明顯的趨向性，但hATMSC的生物安全性尚需進(jìn)一步檢驗。林琳等[13]研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞對體外Hela細(xì)胞的增殖沒有影響，但會促進(jìn)Hela細(xì)胞在體內(nèi)的生長。但劉華等[14]和劉世凱等[15]均發(fā)現(xiàn)，臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可抑制Hela細(xì)胞的增殖，且呈濃度依賴性。CHO等[16]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪和羊水來源的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基的上清液能夠明顯抑制C33-A的增殖，經(jīng)過熱處理后該抑制作用更加明顯。劉華等[14]還發(fā)現(xiàn)人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的凋亡。因此，不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞對宮頸癌生物學(xué)行為的影響尚待研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] SIEGEL R L, MILLER K D, JEMAL A. Cancer statistics,2016[J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66(1): 7-30.

[2] SMITH R A, BROOKS D, COKKINIDES V, et al. Cancer screening in the United States, 2013: a review of current American Cancer Society guidelines, current issues in cancer screening, and new guidance on cervical cancer screening and lung cancer screening[J]. CA Cancer J Clin, 2013,63(2): 88-105.

[3] KATO R, HASEGAWA K, TORII Y, et al. Factors affecting platinum sensitivity in cervical cancer[J]. Oncol Lett, 2015,10(6): 3591-3598.

[4] ZHU H, CHEN A, LI S, et al. Predictive role of galectin-1 and integrin α5β1 in cisplatin-based neoadjuvant chemotherapy of bulky squamous cervical cancer[J]. Biosci Rep, 2017,37(5): BSR20170958.

[5] LI L, WANG D, ZHOU J, et al. Characteristics of human amniotic fluid mesenchymal stem cells and their tropism to human ovarian cancer[J]. PLoS One, 2015, 10(4): e0123350.

[6] LI Z, YE Z, ZHANG X, et al. E1A-engineered human umbilical cord mesenchymal stem cells as carriers and amplifiers for adenovirus suppress hepatocarcinoma in mice[J]. Oncotarget, 2016, 7(32): 51815-51828.

[7] ABRATE A, BUONO R, CANU T, et al. Mesenchymal stem cells expressing therapeutic genes induce autochthonous prostate tumour regression[J]. Eur J Cancer, 2014, 50(14):2478-2488.

[8] HO I A, YULYANA Y, SIA K C, et al. Matrix metalloproteinase-1-mediated mesenchymal stem cell tumor tropism is dependent on crosstalk with stromal derived growth factor 1/C-X-C chemokine receptor 4 axis[J]. FASEB J, 2014, 28(10): 4359-4368.

[9] XU S, MENU E, DE BECKER A, et al. Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells are attracted by multiple myeloma cell-produced chemokine CCL25 and favor myeloma cell growth in vitro and in vivo[J]. Stem Cells, 2012,30(2): 266-279.

[10] MARINI I, SIEGEMUND M, HUTT M, et al. Antitumor activity of a mesenchymal stem cell line stably secreting a tumor-targeted TNF-related apoptosis-inducing ligand fusion protein[J]. Front Immunol, 2017, 8: 536.

[11] KIM N, NAM Y S, IM K I, et al. IL-21-expressing mesenchymal stem cells prevent lethal B-cell lymphoma through efficient delivery of IL-21, which redirects the immune system to target the tumor[J]. Stem Cells Dev, 2015, 24(23):2808-2821.

[12] AHN J O, LEE H W, SEO K W, et al. Anti-tumor effect of adipose tissue derived-mesenchymal stem cells expressing interferon-β and treatment with cisplatin in a xenograft mouse model for canine melanoma[J]. PLoS One, 2013, 8(9): e74897.

[13] 林琳, 孫雯, 王麗雙. 間充質(zhì)干細(xì)胞對人HeLa宮頸癌細(xì)胞生長的影響[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 95(15): 1175-1178.

[14] 劉華, 陳亞娜, 鄭燕, 等. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的影響[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2013, 51(6): 29-33.

[15] 劉世凱, 宋莉莉, 曾賽田, 等. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖特性的影響[J]. 中國組織工程研究, 2015,19(45): 7274-7278.

[16] CHO J A, PARK H, KIM H K, et al. Hyperthermia-treated mesenchymal stem cells exert antitumor effects on human carcinoma cell line[J]. Cancer, 2009, 115(2): 311-323.