程開，陳旭東，呂開績，金勁激，葉曉鮮，張麗芳，朱冠保

（1溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學 微生物學與免疫學教研室 分子病毒與免疫研究所 熱帶醫(yī)學研究所，浙江 溫州 325035）

程序性死亡因子1配體2（programmed cell death 1 ligand 2，PD-L2，又名B7-H1或CD274）與PD-L1（programmed cell death 1 ligand 1，稱為B7-DC或CD273）均屬于程序性死亡因子1（programmed cell death 1，PD1）的配體。PD-L2由PDCD1LG2基因編碼，和PD-L1一樣位于染色體9p24.2，兩者翻譯啟動于同一方向只相隔42 kDa，同屬于B7超家族[1]。PD-L2蛋白含有247個氨基酸，是I型跨膜蛋白，具有IgV樣結(jié)構(gòu)域、IgC樣結(jié)構(gòu)域、胞外區(qū)和胞質(zhì)區(qū)尾部等[2]。之前的觀點認為PD-L2通常只在被激活的巨噬細胞、樹突狀細胞和少數(shù)B細胞中有表達，但近來有研究指出，在某些刺激下PD-L2可大量表達于多種免疫細胞和非免疫細胞中[3]。

PD-L2與PD-1的結(jié)合，能抑制T細胞中的下游通路PI3K（phosphatidylinositol 3-kinase）/AKT（protein kinase B），同時也參與Bcl-xL（B-cell lymphoma-extra large）的抑制，轉(zhuǎn)錄和表達相關(guān)因子如GATA-3（GATA binding protein-3）、Eomes（eomesodermin）等也會隨之受到抑制[3]。這些下游信號的傳遞與PD-L1與PD-1結(jié)合引起的信號轉(zhuǎn)導過程相似。

PD-L2與PD-1的互相作用對T細胞增殖和PD-1非依賴性途徑中IFNγ的產(chǎn)生具有重要的影響，PD-L2與PD-1的相互作用可阻斷細胞周期，并抑制細胞因子產(chǎn)生而使T細胞停止增殖，近來報道腫瘤細胞中的PD-L2存在異常過表達，從而影響宿主細胞的抗腫瘤免疫機制，導致腫瘤細胞的逃避[4]。PD-1/PDL2通路由于其抑制免疫的特性常被腫瘤細胞和多種病原體作為一種免疫逃避的途徑。通過干擾PD-1/PD-L2通路可在很大程度上阻止腫瘤細胞的免疫逃避，達到抗腫瘤或胞內(nèi)寄生病原體的作用[5]。因此，PD-1及其配體PD-Ls的研究，尤其是PD-1/PD-L2通路的阻斷研究已經(jīng)成為腫瘤治療領(lǐng)域新的研究熱點。

現(xiàn)已有幾種針對PD-1和PD-L1而研發(fā)的藥物，如：納武單抗（Nivolumab）、派姆單抗（Keytruda）、派姆單抗（Atezolizumab）等，并在對肺癌、膀胱癌等腫瘤的臨床治療中取得了良好的效果[6]，針對另一種配體PD-L2的研究相對較少。本研究利用生物信息學方法，以PD-L2的氨基酸全序列為基礎(chǔ)，對PD-L2的B細胞表位進行預(yù)測和分析。

1 材料和方法

1.1 人源PD-L2優(yōu)勢B細胞表位預(yù)測

1.1.1 人源PD-L2的全長氨基酸序列：人源PD-L2全長氨基酸序列可在PubMed數(shù)據(jù)庫的protein下進行檢索（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/）或者在uniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行檢索（http://www.uniprot.org/）。

1.1.2 PD-L2二級結(jié)構(gòu)及柔性區(qū)域的預(yù)測：結(jié)合EXPASY服務(wù)器提供的GOR4、SOPMA、ScratchProteinPredictor（SPP）方法（http://www.expasy.ch/tools）對PD-L2全長氨基酸序列進行二級結(jié)構(gòu)的分析，并運用DNAstar軟件的Protein進行柔性區(qū)域的預(yù)測。

1.1.3 PD-L2跨膜區(qū)域的預(yù)測：采用EXPASY服務(wù)器提供的SOSUI、TMpred（http://www.expasy.ch/tools）方法，根據(jù)http://www.uniprot.org網(wǎng)站提供的資料，對PD-L2全長氨基酸序列進行跨膜區(qū)域的分析。

1.1.4 PD-L2親水性、極性、表面可及性和抗原性的預(yù)測：結(jié)合EXPASY服務(wù)器提供的Hopp&Woods（親水性參數(shù)）、Zimmerman（極性參數(shù)）（http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）與DNAstar軟件的Protein進行的Emini（表面可及性參數(shù)）和Jameson-Wolf（抗原性參數(shù)）分析來對PDL2的B細胞表位進行預(yù)測。

1.1.5 PD-L2抗原性指數(shù)分析：結(jié)合上述方法的預(yù)測結(jié)果，并運用吳玉章等[7]建立的抗原性指數(shù)綜合評判人源PD-L2 B抗原細胞表位的優(yōu)勢區(qū)域。

1.2 PD-L2三維結(jié)構(gòu)分析

1.2.1 PD-L2的同源立體構(gòu)象的建立：進入Swiss Institute of Bioinformatics（SIB），在線提交PDL2蛋白氨基酸序列，該服務(wù)器可以在線對比ExPASy數(shù)據(jù)庫，模擬出PD-L2蛋白的3D晶體結(jié)構(gòu)。下載模型文件，我們用PYMOL軟件編輯文件，利用sequence display功能，進行氨基酸序列分析，定位各表位序列預(yù)測得到的表位定位到PD-L2分子上，并對其進行初步的分析。

1.2.2 人源PD-L2 B細胞表位與PD-1結(jié)合位點的空間關(guān)系預(yù)測：使用uniprot服務(wù)器的在線同源性對比，即BLAST功能，將人源PD-L2根據(jù)同源性分析與鼠源PD-L2進行對比，將預(yù)測的人源PD-L2 B細胞表位區(qū)域?qū)?yīng)在鼠源PD-L2序列上。在Protein Data Bank in Europe中獲取已建立的PD-1及PD-L2分子結(jié)合模型資料。相關(guān)模型的PDB編號為“3bp5”，該模型為鼠源PD-1與PD-L2復合體的晶體結(jié)構(gòu)。鼠源PD-1與PD-L2與人源的相應(yīng)蛋白具有較高的同源性，故用作預(yù)測模型。預(yù)測前，應(yīng)用Uniprot服務(wù)器提供的BLAST功能，預(yù)測人源PD-L2蛋白B細胞表位在鼠源PD-L2上的同源區(qū)段，然后在服務(wù)器上下載該模型，使用PYMOL軟件打開并編輯，標記出預(yù)測的表位的同源區(qū)段，并觀察表位與PD-L2、PD-1結(jié)合位點的空間關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 使用統(tǒng)計學軟件SPSS17.0進行分析。用χ2檢驗對PD-L2二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的3種方法進行統(tǒng)計分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 人源PD-L2優(yōu)勢B細胞表位預(yù)測

2.1.1 人源PD-L2的全長氨基酸序列：從uniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫獲得的人源PD-L2（編號：Q9BQ51）的全長氨基酸序列為“MIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTVP KELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHR ERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKY LTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNV SVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVREL TLASIDLQSQMEPRTHPTWLLHIFIPFCIIAFIFIATVIALRKQ LCQKLYSSKDTTKRPVTTTKREVNSAI”共含有273個氨基酸，相對分子質(zhì)量為30.957 kDa。

2.1.2 人源PD-L2二級結(jié)構(gòu)及柔性區(qū)域的預(yù)測：經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)GOR4、SOPMA、SPP 3種方法預(yù)測PD-L2的二級結(jié)構(gòu)，其結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義（P=0.175），見表1，均提示PD-L2的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，亦可見29%～34%的α-螺旋和23%～36%的β-折疊。同時在這3種方案的預(yù)測結(jié)果中，以至少2種方案相一致的重疊區(qū)域為準，并且與柔韌性參數(shù)的預(yù)測相結(jié)合（見圖1），可見無規(guī)則卷曲主要位于N端的25～28，35～38，43～51，62～68，80～84，95～100，123～127，133～138，145～151，162～171，182～189，211～219和252～266區(qū)域。

表1 PD-L2預(yù)測二級結(jié)構(gòu)統(tǒng)計結(jié)果[ n（%）]

2.1.3 人源PD-L2跨膜區(qū)域的預(yù)測：使用TMHMM及TMpred方法預(yù)測PD-L2的跨膜區(qū)域，結(jié)果顯示PD-L2蛋白非可溶性蛋白，可能有1個跨膜區(qū)，即222～243區(qū)段。再結(jié)合uniProt蛋白數(shù)據(jù)庫上的資料，顯示PD-L2可靠的跨膜區(qū)在221～241區(qū)段，即1～220在胞外，242～273在胞內(nèi)。見表2。

圖1 柔韌性參數(shù)預(yù)測結(jié)果

表2 TMHMM及TMpred服務(wù)器對PD-L2跨膜區(qū)域預(yù)測結(jié)果匯總

2.1.4 人源PD-L2親水性、表面可及性、極性、抗原性的預(yù)測綜合分析：結(jié)合EXPASY網(wǎng)站提供的2個在線結(jié)構(gòu)服務(wù)器，以及DNASTAR軟件預(yù)測PD-L2的親水性、表面可及性、極性、抗原性參數(shù)的預(yù)測（見表3和圖2），應(yīng)用不同參數(shù)預(yù)測的B細胞抗原表位肽段略有差異，而氨基酸片段45，60～76，93～98，120～125，133～139，164～172，182～187，210～217，246～247，252～269在多種預(yù)測方法中一致（抗原性指數(shù)≥0，親水性指數(shù)≥0，表面可及性指數(shù)≥1，極性指數(shù)≥12）。

2.1.5 人源PD-L2抗原性指數(shù)分析：綜合PD-L2的親水性、表面可及性、極性、抗原性參數(shù)的預(yù)測一致區(qū)域，計算PD-L2的B細胞表位區(qū)域的平均抗原性指數(shù)，結(jié)果顯示N端的60～72，93～97，133～139，164～171和253～269區(qū)段的抗原性指數(shù)相對較高（見表4），提示其可能為B細胞表位的優(yōu)勢區(qū)域。結(jié)合上述分析，人源PD-L2胞膜外區(qū)的60～72，93～97，133～139，164～171區(qū)段，即PD-L2蛋白的氨基酸序列60-72（QKVENDTSPHRER），93-97（QVRDE），133～139（VPETDEVEL），164～171（TSHSRTPE）為免疫優(yōu)勢線性B細胞表位。

表3 PD-L2二級結(jié)構(gòu)、親水性、表面可及性、極性、抗原性的預(yù)測綜合分析

圖2 PD-L2親水性、表面可及性、極性、抗原性參數(shù)預(yù)測的示意圖

2.2 PD-L2三維結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 PD-L2的同源立體構(gòu)象的建立：在swiss-model服務(wù)器上提交分子序列，查詢結(jié)果顯示PDB代號為3bp6B的鼠源PD-L2氨基酸序列與人源PD-L2氨基酸序列的推導序列同源性高達73%，故以3bp6B作為同源建模的模板序列，建立模型后，以PYMOL軟件進行編輯，進行氨基酸序列分析后，獲得的分子“cartoon”模型結(jié)果見圖3A，PD-L2蛋白空間結(jié)構(gòu)中較少典型的α-螺旋，較多β-折疊結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲散在分布，使其與周圍的極性環(huán)境能夠充分接觸，有利于抗原表位的形成，而上述預(yù)測的PD-L2的B細胞表位都包含了這種轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，這可以反證本研究對于人源PD-L2 B細胞表位的預(yù)測。進一步分析分子的表面模型，可以看出，4段表位序列的氨基酸均處于PD-L2的表面，且同為一側(cè)，具有構(gòu)成構(gòu)象表位的潛力。見圖3B。

表4 PD-L2的B細胞表位預(yù)測結(jié)果

圖3 PD-L2的立體結(jié)構(gòu)圖

2.2.2 人源PD-L2 B細胞表位與PD-1結(jié)合位點的空間關(guān)系預(yù)測：使用uniprot服務(wù)器的在線BLAST工具，將人源的PD-L2序列與鼠源PD-L2相對應(yīng)，結(jié)果見圖4。根據(jù)Protein Data Bank in Europe中已建立的鼠源PD-1及PD-L2分子結(jié)合模型資料“3bp5”，使用PYMOL軟件，標記出人源PD-L2預(yù)測的各B細胞表位的同源區(qū)段，并分析B細胞表位與人源PD-1分子間的位置關(guān)系。如圖5所示：分子表面標記為灰色網(wǎng)狀的模型為鼠源PD-1蛋白，粉色的分子表面模型為其配體鼠源PD-L2蛋白，上述所預(yù)測的B細胞表位用不同的顏色加以區(qū)別，可以看出藍色標記的表位即“QKVENDTSPHRER”在PD-1和PD-L2之間的結(jié)合區(qū)域之內(nèi)。

3 討論

由于PD-1/PD-L2在腫瘤的免疫逃逸中起到的作用，它成為了一種新的腫瘤治療思路，阻斷此途徑，腫瘤細胞的免疫逃避機制就會在一定程度上受到干擾，從而使得腫瘤細胞被免疫細胞識別乃至消滅[8]。如何阻斷PD-1/PD-L2進而影響腫瘤細胞免疫逃避機制成為了一項熱門的研究。目前已知，PD-1并不一定是PD-L2影響T細胞免疫功能的唯一受體。已有報道稱，在PD-1缺失的小鼠模型中，PD-L2在T細胞中仍能發(fā)揮其功能，由此推測PD-L2可能還與其他受體結(jié)合，參與另外的信號通路[3]。因此以PDL2為靶點的研究在腫瘤的治療方面具有重要意義，本研究以預(yù)測PD-L2的B細胞表位為研究目的，可為進一步抗PD-L2的各種類抗體的制備及其對PD-1/PDL2通路，甚至腫瘤細胞免疫逃避的阻斷和干擾提供理論支持。

B細胞表位是B細胞表面的受體也就是膜結(jié)合抗體所識別和結(jié)合的抗原決定簇，它可以通過刺激B細胞產(chǎn)生抗體，這種特異性抗體經(jīng)由免疫調(diào)理、激活補體和介導ADCC等途徑[9]，發(fā)揮抗腫瘤的免疫效應(yīng)[10]。B細胞表位的預(yù)測對疫苗設(shè)計、免疫診斷試驗、抗體研制有很大的用處[11]。直接對B細胞表位進行制圖，可以通過在實驗室里制備目的蛋白及其單克隆抗體，使其形成免疫復合物結(jié)晶，再以X衍射的方法分析抗原抗體復合物相互作用的區(qū)域，此類方法成本高、耗時長、復雜程度高[12]，因此我們所用的預(yù)測方法具備了實用價值。由于鼠源的PD-1和PD-L2蛋白在結(jié)合區(qū)域上的氨基酸殘基分別約有12/16和10/14的序列與人源的相同，現(xiàn)有的文獻所建立的針對PD-L2的晶體結(jié)構(gòu)模型主要為鼠源[13]，而缺乏對于人類來源的PD-L2蛋白的重點研究，因此本研究獲取了鼠源的PD-L2/PD-1結(jié)合模型，并通過鼠源的模型對于人源PD-1/PD-L2蛋白的結(jié)合情況進行模擬與預(yù)測。

圖4 人源PD-L2與鼠源PD-L2 BLAST結(jié)果

圖5 鼠源PD-L2與PD-1的結(jié)合模型

本研究通過生物信息學分析，利用各種在線軟件對PD-L2的B細胞表位進行了預(yù)測和分析，這種方法經(jīng)過多年的發(fā)展補充，已經(jīng)較為成熟，得到了廣泛的認可和應(yīng)用[14-16]，且本實驗室分別對沙眼衣原體的外膜蛋白（MOMP）和EB病毒的潛伏膜蛋白的B細胞表位進行過預(yù)測和鑒定，結(jié)果表明使用生物信息學方法得到的B細胞表位免疫小鼠獲得的免疫血清可特異性識別天然抗原，反之沙眼衣原體感染和EBV感染患者的血清也可識別篩選的B細胞表位[17]，驗證了生物信息學的B細胞表位預(yù)測具有準確性。獲得了具有免疫優(yōu)勢的4個線性B細胞表位，即QKVENDTSPHRER，QVRDE，VPETDEVEL，TSHSRTPE，為進一步的抗體研究提供了基礎(chǔ)。

本研究還進一步通過生物信息學的在線分析軟件，建立了人源PD-L2蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型，對獲得的PD-L2的4個線性B細胞表位與PD-L2和其結(jié)合蛋白PD-1之間的結(jié)合位點的空間關(guān)系進行了分析。結(jié)果表明，本實驗所預(yù)測的4個表位，即60～72（QKVEN DTSPHRER），93～97（QVRDE），133～139（VPETDEVEL），164～171（TSHSRTPE）都包括了模型中的轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，有利于抗原表位的形成，佐證了上述預(yù)測結(jié)果。通過進一步對PD-1和PD-L2蛋白的立體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，我們所預(yù)測的PD-L2的B細胞表位“QKVENDTSPHRER”位于PD-1和PD-L2之間的結(jié)合區(qū)域之內(nèi)，具有重要的進一步研究的應(yīng)用價值。

本研究首先通過上述方法綜合分析預(yù)測了PDL2氨基酸序列中有可能的B細胞優(yōu)勢表位，并進一步對表位“QKVENDTSPHRER”的進行了分析及分子立體構(gòu)象，及其與相應(yīng)配體PD-1的結(jié)合構(gòu)象進行了初步預(yù)測。綜上述，本研究結(jié)果為PD-L2的B細胞表位研究及進一步鑒定提供了理論基礎(chǔ)。

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