童建波 杜蕾蕾 曾 榮 王麗瑋 劉宇甄 段志敏 陳 青 李 岷

由于廣譜抗菌藥物、糖皮質激素和免疫抑制劑的廣泛使用，放療、化療、器官移植以及侵入性治療措施的急劇增加，艾滋病等免疫缺陷性疾病的流行，侵襲性曲霉病的發(fā)病率在近年來快速上升[1]。據(jù)統(tǒng)計該病的致死率可高達50%～95%，而煙曲霉是最常見的致病菌[2]。宿主單核巨噬細胞作為固有免疫中重要反應細胞，能識別并清除入侵的煙曲霉[3]。本研究旨在探討煙曲霉能否激活人急性單核細胞白血病細胞系細胞(THP-1)的信號分子NF-κB抑制蛋白(IκBɑ)，誘導白細胞介素6(IL-6)的分泌。

1 材料和方法

1.1 細胞、菌株、主要試劑 煙曲霉Af293(ATCC MYA-4609, CBS 101355)、人THP-1細胞株購自美國American Type Culture Collection(ATCC)。兔抗人IκBɑ和磷酸化IκBɑ抗體為美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品。IL-6酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒為欣博盛公司產(chǎn)品。PrimeScript RT Master Mix逆轉錄酶試劑盒為日本TaKaRa公司產(chǎn)品。iTaq Universal SYBR Green Supermix為美國Bio-rad公司產(chǎn)品。巴豆酯(PMA)、β-葡聚糖(β-Glucan)、抑制劑BAY 11-7082為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng) 煙曲霉Af293在蛋白胨沙氏瓊脂培養(yǎng)基(SDA)37℃培養(yǎng)3天收集煙曲霉孢子經(jīng)56℃60 min水浴滅活后，配制成不同濃度菌懸液待用。人THP-l細胞用含10%胎牛血清、l%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。將細胞制備成105/mL細胞懸液，接種于12孔細胞培養(yǎng)板每孔1 mL及6孔細胞培養(yǎng)板每孔2 mL，加入100 g/L PMA刺激48 h后，予不同濃度煙曲霉共培養(yǎng)。

1.3 實時熒光定量逆轉錄PCR 終濃度為106CFU/mL和107CFU/mL煙曲霉與2×105/mL THP-1共孵育，并設陽性刺激物β-Glucan(100 g/L)組、培養(yǎng)基空白對照組、抑制劑BAY 11-7082組(10 μM BAY 11-7082預先與THP-1細胞共培養(yǎng)2 h)。TRIzol法抽提總RNA，按PrimeScript RTMaster Mix逆轉錄酶試劑盒說明書將1 μg總RNA反轉錄為cDNA。使用ABI 7300 PCR儀，采用Syber green法對目的基因進行擴增。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的變化水平，ΔCt=目的基因-內參照(β肌動蛋白)；某一樣品的ΔΔCt=某一樣品ΔCt-對照組樣品的ΔCt。相關基因引物見表1。

1.4 Western印跡分析 煙曲霉懸液(107CFU/mL)作用的THP-1細胞，裂解細胞，提取總蛋白。等量蛋白的不同樣品梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉至聚偏二氟乙烯膜上。5% BSA封閉2 h，兔抗人單克隆抗體4℃孵育過夜。TBST液洗膜3次后，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG第二抗體反應2 h，TBST液洗膜3次，Supersignal試劑顯色發(fā)光，檢測IκBα和磷酸化IκBα的水平。

1.5 ELISA法 刺激THP-l細胞后24 h，收集上清液，按照試劑盒說明書檢測IL-6含量。

2 結果

2.1 煙曲霉對IL-6 mRNA水平的影響 刺激后1、3和6 h，不同濃度煙曲霉組、LPS組、空白對照組的IL-6 mRNA水平變化情況，見表2。107CFU/mL煙曲霉刺激THP-1細胞后3、6 h，IL-6 mRNA水平明顯高于空白對照組(P<0.001)。107CFU/mL煙曲霉刺激THP-1細胞后1、3、6 h，IL-6 mRNA水平與空白對照組比較，P值分別為0.036、0.001、<0.001。

2.2 煙曲霉對IL-6蛋白分泌的影響 根據(jù)實時定量PCR結果，選取煙曲霉刺激效果較好的濃度107CFU/mL刺激后24 h，煙曲霉組、β-Glucan組、空白對照組的上清液中IL-6濃度的分別為(879.86±32.35)ng/L、(256.13±6.26)ng/L、(10.67±0.17)ng/L，煙曲霉組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。

表1 實驗所用引物序列

表2 煙曲霉對人THP-1細胞株IL-6 mRNA水平的影響

注：與空白對照組比較，aP<0.05；bP<0.001；cP<0.01

2.3 煙曲霉對THP-1細胞IκBɑ激活的影響 刺激后30 min，磷酸化IκBɑ蛋白水平已有升高，60 min時磷酸化IκBɑ蛋白水平顯著升高；IκBɑ蛋白水平則相應有所降低。提示煙曲霉能夠激活THP-1細胞信號分子IκBɑ。見圖1。

1：空白對照組 2：作用15 min 3：作用30 min 4：作用60 min煙曲霉刺激后30 min即出現(xiàn)IκBɑ蛋白磷酸化，60 min時IκBɑ磷酸化水平顯著升高，而對應的IκBɑ水平相應降低。

圖1 煙曲霉體外作用THP-1細胞后不同時間IκBɑ和磷酸IκBɑ的水平

2.4 NF-κB信號通路抑制劑BAY 11-7082對煙曲霉上調THP-1細胞IL-6 mRNA水平的影響 10 μM BAY 11-7082預先與THP-1細胞共培養(yǎng)2 h后，再用107CFU/mL煙曲霉、β-葡聚糖刺激6 h IL-6 mRNA表達水平見表3。經(jīng)統(tǒng)計分析，3組是否采用BAY 11-7082 IL-6mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學意義(F=20.02，P<0.01，v=2)，抑制劑BAY 11-7082可阻斷煙曲霉上調IL-6 mRNA水平。

表3 NF-κB信號通路抑制劑BAY 11-7082對煙曲霉上調THP-1細胞IL-6 mRNA 水平的影響

注：a：與空白對照組比較，P<0.001；b：與未用BAY 11-7082阻斷組比較，P<0.001

3 討論

固有免疫反應是抵抗真菌入侵的第一道防線，中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞作為主要的固有免疫細胞，在啟動抗煙曲霉感染中發(fā)揮重要作用[4,5]。IL-6是炎癥起始階段的一個重要致炎因子，在天然免疫系統(tǒng)中分布廣泛，它通過誘導多種細胞合成和分泌多種急性期蛋白，促進感染時中性粒細胞產(chǎn)生、活化，促進B細胞增殖、分化及產(chǎn)生免疫球蛋白，促進T細胞增殖、分化等，在急性期炎癥反應中起重要作用。在真菌感染早期可誘導Th0細胞向Th17細胞分化，抵抗真菌感染[6,7]。在早期一項研究中發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，巨噬細胞游走抑制因子(MIF)基因敲除小鼠IL-6及IL-17水平顯著下降，對煙曲霉的感染更為敏感，抗真菌感染的能力明顯減弱[8]。THP-1細胞為來源于急性單核細胞白血病患者的細胞系，具有分化的潛能，可經(jīng)佛波酯PMA誘導向巨噬細胞方向分化，細胞純度高，取材方便，是體外研究炎癥的良好細胞模型。THP-1細胞在正常培養(yǎng)時為懸浮狀態(tài)，經(jīng)過PMA刺激后，可以伸出偽足，吸附于細胞培養(yǎng)瓶中，成為貼壁狀態(tài)，此過程在短時期內不可逆轉。因此，選擇類似于人體內單核-巨噬細胞系的THP-1細胞作為本實驗的研究對象，可以在一定程度上模擬煙曲霉感染人體、侵犯機體固有免疫系統(tǒng)的過程。

本研究初步發(fā)現(xiàn)，106、107CFU/mL煙曲霉作用THP-1細胞后，上調IL-6 mRNA水平均出現(xiàn)時間依賴效應，在刺激后3 h出現(xiàn)上升，刺激后6 h，106CFU/mL煙曲霉組mRNA水平為3 h的6.8倍，107CFU/mL組則升高15.2倍。本研究采用β-Glucan作為激活THP-1細胞的陽性對照物，能誘導出相同的時間依賴效應，刺激6 h后IL-6 mRNA水平比3 h組上升7.7倍。刺激后3 h，106CFU/mL組IL-6 mRNA水平為8.27±0.29，107CFU/mL組為13.79±0.62，后者為前者的1.6倍。刺激后6 h，兩組分別為56.86±11.25和209.38±25.35，高濃度煙曲霉組為低濃度組的3.7倍，提示煙曲霉上調IL-6 mRNA水平為劑量依賴效應。本研究結果表明，107CFU/mL作用THP-1細胞24 h后，上清液中IL-6含量為(879.86±32.35)pg/mL，與空白對照組(10.67±0.17 pg/mL)比較，明顯上升，表明煙曲霉能在mRNA水平誘導THP-1細胞上調IL-6轉錄，在蛋白水平增強該因子的分泌。

NF-κB作為一種轉錄因子在調控前炎癥因子轉錄表達中起重要作用，NF-κB家族蛋白包括p50/p105、p52/p100、p65/RelA、RelB及c-Rel。通常NF-κB以二聚體形式存在，靜息狀態(tài)下，與NF-κB 抑制蛋白(inhibitor proteins of NF-κB，IκB)結合，并以無活性形式存在于胞質中；當細胞接受適宜刺激后，IκB在IKB激酶(IκB kinase，IKK)誘導下發(fā)生磷酸化。IκB即發(fā)生多泛素化反應，再被蛋白酶體降解，激活NF-κB?；罨腘F-κB暴露出核定位序列，從而進入核內與脫氧核糖核酸特定位點結合，啟動基因轉錄，產(chǎn)生并釋放細胞因子[9,10]。而IκBɑ磷酸化抑制劑Bay 11-7082可抑制NF-κB活化的幾乎所有環(huán)節(jié)，包括IκBɑ磷酸化和降解、p65磷酸化及p50、p65和c-Rel核轉移[11]。本實驗結果表明，煙曲霉刺激后30 min即出現(xiàn)IκBɑ蛋白磷酸化，60 min時IκBɑ磷酸化水平顯著升高，而對應的IκBɑ水平相應降低。

我們進一步通過NF-κB抑制劑Bay 11-7082阻斷信號通路，即用10 μM BAY 11-7082預先與THP-1細胞共培養(yǎng)后，再用107CFU/mL煙曲霉刺激，可以觀察到IL-6 mRNA 表達水平(2.19±0.62)較未用BAY 11-7082組(206.18±20.43)明顯減低，BAY 11-7082可阻斷煙曲霉上調 IL-6 mRNA水平。提示煙曲霉可誘導THP-1細胞中作為NF-κB二聚體抑制劑的IκBɑ分子出現(xiàn)活化，其對NF-κB抑制效應隨之降低，最終導致NF-κB活化入核，調節(jié)IL-6等前炎癥因子的轉錄表達。

煙曲霉對人THP-1 細胞刺激后可出現(xiàn)IκBɑ蛋白磷酸化，IL-6在 mRNA 水平、蛋白水平表達量升高，并且在一定程度內呈現(xiàn)劑量依賴性、時間依賴性。表明人THP-1細胞體外與煙曲霉共培養(yǎng)后激活信號分子IκBɑ并分泌IL-6，參與抗煙曲霉感染固有免疫反應。因此，可能為今后的臨床治療提供新的治療靶點和理論基礎。

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