高珊珊， 石 晗， 齊 虹， 田家宇

(1. 河北工業(yè)大學(xué) 土木與交通學(xué)院， 天津 300401； 2. 哈爾濱工業(yè)大學(xué) 環(huán)境學(xué)院， 哈爾濱 150090)

0 引 言

液相色譜質(zhì)譜(LC-MS)分析法由于具有靈敏度高、樣品用量少、分析速度快、分離和鑒定同時(shí)進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)逐步成為環(huán)境領(lǐng)域中非常重要的分析方法[1-5]。樣品的預(yù)處理過(guò)程是液相色譜質(zhì)譜分析的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，樣品處理效果的好壞直接影響后續(xù)儀器測(cè)試所得數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

樣品的預(yù)處理方法很多，有液液萃取、膜萃取、液相微萃取、固相萃取法等[6-7]。其中，固相萃取法(SPE)由于具有對(duì)目標(biāo)物選擇性強(qiáng)、有機(jī)溶劑使用量少、分離操作時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)在環(huán)境領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛[8-10]。SPE技術(shù)的關(guān)鍵是根據(jù)目標(biāo)物的化學(xué)性質(zhì)(如極性、pKa、分子量、濃度等)選擇適合的固相萃取柱。目前，實(shí)驗(yàn)室中多采用C18柱，C18柱適合于分離非極性到中等極性的化合物。但對(duì)于極性較強(qiáng)的陰離子化合物，則可采用弱陰離子型的Wax柱，該固相萃取柱對(duì)強(qiáng)酸性陰離子化合物具有高的選擇性和靈敏度，適用于合成著色劑和強(qiáng)酸性有機(jī)物的預(yù)處理，如磺酸鹽、全氟酸等。以全氟辛酸(PFOA)為例，PFOA為強(qiáng)極性、強(qiáng)酸性、陰離子化合物，pKa僅為2.5，采用傳統(tǒng)C18固相萃取，回收率較低，而采用Wax柱進(jìn)行固相萃取，則能取得很好的效果。

結(jié)合我學(xué)院環(huán)境學(xué)科的特點(diǎn)，本文以液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)為核心內(nèi)容，設(shè)立了“固相萃取-液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法定性分析全氟辛酸(PFOA)”這一實(shí)驗(yàn)課，目的是使學(xué)生了解液相色譜質(zhì)譜儀的基本組成和功能原理；學(xué)習(xí)和掌握質(zhì)譜儀器的基本操作和分析方法；掌握利用固相萃取技術(shù)對(duì)環(huán)境樣品進(jìn)行預(yù)處理的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 基本原理

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是指高效液相色譜(HPLC)與質(zhì)譜(MS)串聯(lián)的技術(shù)，該技術(shù)結(jié)合了HPLC的高效分離能力和MS的高靈敏度和極強(qiáng)的專屬性的分離檢測(cè)技術(shù)，目前已成為有機(jī)物分析的重要方法之一。HPLC-MS系統(tǒng)組成如圖1所示，HPLC-MS樣品分析過(guò)程為：待測(cè)樣品通過(guò)進(jìn)樣器進(jìn)入液相色譜系統(tǒng)，由色譜柱分離，從色譜儀流出的被分離組分依次進(jìn)入質(zhì)譜的離子源處被離子化，然后離子被聚焦于質(zhì)量分析器中，根據(jù)質(zhì)荷比而分離，分離后的離子信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，傳送至數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。以檢測(cè)器檢測(cè)到的離子信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，離子質(zhì)荷比為橫坐標(biāo)所得的條狀圖就是常見(jiàn)的質(zhì)譜圖。

圖1 HPLC-MS系統(tǒng)組成

本實(shí)驗(yàn)所用液質(zhì)聯(lián)用儀采用的是電噴霧電離源，該離子源為軟電離，即化合物在一級(jí)質(zhì)譜電離過(guò)程中不易發(fā)生分解，通常產(chǎn)生(M+H)+或(M-H)-等準(zhǔn)分子離子，便于進(jìn)行分子量確認(rèn)。多級(jí)質(zhì)譜分析則是通過(guò)對(duì)準(zhǔn)分子離子進(jìn)行多級(jí)裂解，獲得子離子碎片信息，進(jìn)而給出該分子離子和準(zhǔn)分子離子的結(jié)構(gòu)信息，實(shí)現(xiàn)對(duì)未知物質(zhì)的高質(zhì)量定性分析。

SPE是一種吸附劑萃取技術(shù)，利用選擇性吸附和選擇性洗脫的液相色譜法分離原理，樣品通過(guò)萃取柱時(shí)，目標(biāo)物和雜質(zhì)被保留在柱上，然后用選擇性溶劑去除雜質(zhì)，再洗脫出目標(biāo)物，從而達(dá)到目標(biāo)物分離、凈化和濃縮的目的。

PFOA是一類脂肪烴碳鏈上與碳原子相連的氫原子被氟原子取代的人工合成化合物，具有表面活性強(qiáng)、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、耐酸堿、耐強(qiáng)氧化劑等獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)和生活中。該類物質(zhì)在自然環(huán)境和生物體中被頻繁檢出，其遷移和轉(zhuǎn)化為環(huán)境領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題[11-14]。實(shí)驗(yàn)選取PFOA作為目標(biāo)物，采用Wax柱對(duì)其進(jìn)行凈化和濃縮。該固相萃取過(guò)程依靠PFOA與填料層的吸附劑之間的靜電引力實(shí)現(xiàn)。因此，實(shí)驗(yàn)需要調(diào)節(jié)溶液的pH以改變目標(biāo)物或者吸附劑的離子化或者質(zhì)子化程度，PFOA的pKa為2.5，在pH為2～14范圍內(nèi)，PFOA均以陰離子形式存在，而Wax柱的pKa=6，當(dāng)pH<4時(shí)，Wax以正離子形式存在，可以吸附陰離子的PFOA；pH調(diào)至>7時(shí)，Wax以質(zhì)子形式存在，與PFOA發(fā)生解吸附。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和材料

實(shí)驗(yàn)儀器：美國(guó)賽默飛液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、美國(guó)SUPELCO固相萃取裝置、精密電子天平、pH計(jì)。

實(shí)驗(yàn)耗材和試劑：甲醇、乙腈、乙酸和乙酸銨均為色譜級(jí)、Wax固相萃取柱(Waters Oasis 6cc，150 mg，30 μm)、18.2 Ω超純水、0.1 mol/L HCl、氨水(分析純)。

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀運(yùn)行條件：液相分離使用C18色譜柱 (美國(guó)Waters公司，XbridgeTM, 2.1×150 mm, 5 μm)，液相操作條件：柱溫30 °C；進(jìn)樣量：20 μL；流速0.3 mL/min，流動(dòng)相乙腈和超純水(含10 mmol/L乙酸銨)的體積比1∶1。質(zhì)譜離子源為電噴霧(ESI)離子源，分析器為離子阱。質(zhì)譜操作條件：電噴霧電壓5 300 V；鞘氣和輔助氣為高純氮?dú)猓魉?0 L/min；噴霧室溫度370 °C；碰撞氣為高純氦氣；離子源為負(fù)離子模式(ESI-)；掃描范圍50～700 m/z。二級(jí)和多級(jí)質(zhì)譜掃描碰撞能量為20%～50%。

1.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.3.1水樣配制

配制濃度為1 μg/L的PFOA水樣50 mL，用HCl(0.1 mol/L)調(diào)節(jié)水樣pH=4。

1.3.2樣品固相萃取

(1) 固相萃取柱的活化。依次用4.0 mL 0.1%氨水甲醇(甲醇為溶劑)和4.0 mL甲醇對(duì)固相萃取柱進(jìn)行活化，再用4.0 mL超純水淋洗。

(2) 上樣。加入50 mL水樣，通過(guò)活塞和真空泵控制流速為1滴/s。

(3) 固相萃取柱的清洗。用4.0 mL 25 mmol/L乙酸銨緩沖液(pH 4～5)對(duì)固相萃取柱進(jìn)行凈化以去除其他雜質(zhì)。

(4) 固相萃取柱的干燥。將固相萃取柱放入離心機(jī)中以3 000 r/min的速度運(yùn)行2 min。

(5) 目標(biāo)物的洗脫。依次加入4.0 mL甲醇和4.0 mL 0.1%氨水甲醇以洗脫目標(biāo)物，并收集于10 mL的玻璃離心管中。

1.3.3樣品濃縮

將上述所得的洗脫液用氮吹儀濃縮至1 mL以下，再加入甲醇定容至1 mL。所得的溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。

1.3.4樣品液質(zhì)分析

(1) 更換所需流動(dòng)相，并運(yùn)行在線脫氣程序。

(2) 建立液相色譜分析方法，包括設(shè)置流動(dòng)相比例、流速、柱溫等(詳見(jiàn)1.2)。

(3) 建立質(zhì)譜分析方法，包括電噴霧電壓、噴霧室溫度、掃描模式、掃描范圍以及多級(jí)質(zhì)譜碰撞能量的設(shè)定等(詳見(jiàn)1.2)。

(4) 放入待測(cè)試樣，運(yùn)行色譜和質(zhì)譜程序。

1.3.5數(shù)據(jù)分析

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)操作，即可獲得質(zhì)譜圖，在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的使用中，質(zhì)譜圖的解析至關(guān)重要。

首先對(duì)PFOA水樣進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，如圖2所示(橫坐標(biāo)為質(zhì)荷比m/z，縱坐標(biāo)為相對(duì)豐度)，得到了m/z=412.68的分子離子峰，該物質(zhì)即為PFOA分子的質(zhì)譜譜圖，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2。

圖2 PFOA的一級(jí)質(zhì)譜圖和結(jié)構(gòu)示意圖

該儀器的多級(jí)質(zhì)譜過(guò)程是母離子與碰撞池中的碰撞氣體相撞而產(chǎn)生離子碎片，碰撞能量以百分比(%)表示，該值越高，則碰撞能量越強(qiáng)，母離子裂解生成的離子碎片在數(shù)量和種類也相應(yīng)發(fā)生變化。圖3所示為PFOA的二級(jí)質(zhì)譜圖。以m/z=412.68為母離子，在轟擊能量為25%時(shí)，可得到母離子m/z=412.65和離子碎片m/z=368.86的峰。后者是由于前者發(fā)生碳碳健斷裂而形成的，其斷裂位置見(jiàn)圖3。讓學(xué)生自己嘗試優(yōu)化碰撞能量值，以使主離子碎片的豐度響應(yīng)值最高。當(dāng)設(shè)置碰撞能量為30%時(shí)(圖3(b))，僅得到離子碎片m/z=368.85的子離子碎片峰。說(shuō)明碰撞能量增大導(dǎo)致母離子全部發(fā)生碎裂。因此，在本實(shí)驗(yàn)中PFOA二級(jí)質(zhì)譜掃描的碰撞能量30%優(yōu)于25%。

(a) 碰撞能量為25%

(b) 碰撞能量為30%

圖3 PFOA的二級(jí)質(zhì)譜圖和離子碎片生成示意圖

為激發(fā)學(xué)生興趣，可鼓勵(lì)學(xué)生進(jìn)一步做三級(jí)質(zhì)譜分析，得到的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4。得到m/z=368.61，218.92，168.84的碎片離子峰，金航標(biāo)等[15]在PFOA多級(jí)質(zhì)譜中也得到了類似的子離子碎片。根據(jù)獲得的離子碎片的質(zhì)荷比，推測(cè)m/z=218.92和168.84分別是368.61在碳三和碳四處發(fā)生碳碳鍵斷裂所形成，碎裂機(jī)理如圖4所示。

21.4固相萃取過(guò)程中的注意事項(xiàng)

(1) 固相萃取柱按照柱容量分為不同的規(guī)格，有100 mg/1 mL、200 mg/3 mL和500 mg/6 mL等，要求目標(biāo)物的質(zhì)量不超過(guò)柱內(nèi)填料量的5%。

(2) 活化過(guò)程中不能讓填料層暴露在空氣中，因?yàn)闅怏w會(huì)在固定相和水樣之間形成氣膜，阻礙水樣中的目標(biāo)物向固定相的分配，降低目標(biāo)物回收率。

圖4 PFOA的三級(jí)質(zhì)譜圖和離子碎片生成示意圖

(3) 上樣的流速不能過(guò)快，否則會(huì)影響目標(biāo)化合物在固定相的保留。

2 結(jié) 語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)教學(xué)是環(huán)境專業(yè)研究生培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)?！肮滔噍腿?液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法定性分析PFOA”實(shí)驗(yàn)課共6學(xué)時(shí)，3學(xué)時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)原理講解和固相萃取實(shí)驗(yàn)，獲取目標(biāo)洗脫物后將樣品放入氮吹儀進(jìn)行樣品濃縮。3學(xué)時(shí)進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用儀的講解和操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果由學(xué)生在課后進(jìn)行分析。該實(shí)驗(yàn)涉及到樣品預(yù)處理技術(shù)、現(xiàn)代色譜學(xué)和質(zhì)譜學(xué)，具有知識(shí)點(diǎn)多、綜合性強(qiáng)的特點(diǎn)，可全面提升學(xué)生的科研能力和實(shí)驗(yàn)操作能力。到目前，該實(shí)驗(yàn)課已開(kāi)設(shè)5年，受到學(xué)生廣泛好評(píng)，實(shí)驗(yàn)效果比較理想。

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