劉曉鋼，周林，徐莉娜，李艷婷，周偉，郭尚*，侯雷平*(.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 03080；.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食用菌研究所，山西 太原 03003)

1 材料與方法

1.1 材料

試材：FomitiporiayanbeiensisS. Guo & L. Zhou 菌株由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供(SXSYJJZ No.1510)。

培養(yǎng)基：(1)平板培養(yǎng)基：PDA。(2)液體培養(yǎng)基：營養(yǎng)源：葡萄糖(2 %)、蛋白胨(3 %)、KH2PO4(0.05 %)、MgSO4(0.05 %)、VB1(100 μg·L-1)、VB2(500 μg·L-1)；培養(yǎng)條件：轉(zhuǎn)速130 r·min-1、溫度24 ℃、pH自然；制作方法：將營養(yǎng)成分在水中溶解后放于裝有80 mL發(fā)酵培養(yǎng)液的250 mL三角培養(yǎng)瓶中經(jīng)121 ℃，0.15 MPa滅菌0.5 h后備用。

試劑：氫氧化鈉(GB/T 601-2002)、可溶性淀粉(Starch soluble CASNO:9005-84-9)尿素和蛋白胨(CASNO:57-13-6)為天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，葡萄糖(HG/T 3475-1999，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)、乳糖(HG/T 346-2012，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、蔗糖(HG/T 3462-2013，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)、海藻糖(日本林原)、硫酸銨(GB/T 1396-1993 XK13-201-0015，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)、牛肉膏、豆粕粉和VB1(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、VB2(天津市光復(fù)精細化工研究所)。

儀器與設(shè)備：高壓滅菌鍋、pH分析儀、40目過濾網(wǎng)、打孔器、分析天平、電熱鼓風(fēng)干燥箱、高速離心機、恒溫搖床、磁力攪拌器、勻漿器等。高速離心機(Eppedorf)、高壓滅菌鍋(重慶雅馬拓科技有限公司)、PH分析儀(ST2100，奧豪斯儀器(常州)有限公司)、分析天平(ST2100，METTLER TOLEDO Made in Suitzerland)、電熱鼓風(fēng)干燥箱(GR-23，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、恒溫搖床(GR-200，上海茸研儀器有限公司)、磁力攪拌器(上海博訊設(shè)備有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 液體發(fā)酵液的培養(yǎng)方法

將山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供菌株接種到1.1中的無菌平板培養(yǎng)基當(dāng)中，于24 ℃在恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，待菌絲長滿后用打孔器在平板上取直徑為0.2 cm大小菌種，將其接種到裝有80 mL發(fā)酵培養(yǎng)液的250 mL三角培養(yǎng)瓶中，在轉(zhuǎn)速130 r·min-1、溫度24 ℃、pH為7.0的條件下培養(yǎng)7 d，接種時將菌種在磁力攪拌器上攪成勻質(zhì)后，在超凈工作臺上用移液槍接種到液體培養(yǎng)瓶中在恒溫搖床上震蕩培養(yǎng)。

1.2.2 單因素試驗

分別對液體培養(yǎng)的碳源、氮源、pH、接種量、培養(yǎng)溫度進行試驗分析(表1)，試驗設(shè)3次重復(fù)。

表1單因素試驗和水平

Table1 The experimental conditions of single factor and levels

水平Level碳源Csource氮源NsourcepHpH接種量/%Inoculumsize培養(yǎng)溫度/℃Tempreture1海藻糖豆粕粉5 05212可溶性淀粉蛋白胨6 08243葡萄糖尿素7 011274乳糖硫酸銨8 014305蔗糖牛肉膏9 01733

1.2.3 正交試驗優(yōu)化高產(chǎn)菌球生物量培養(yǎng)基配方

在以上單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇碳源、氮源、磷酸二氫鉀和硫酸鎂作為四種考察因素，每組試驗設(shè)三次重復(fù)(表2)。以發(fā)酵液的菌球生物量作為測定指標(biāo)，通過正交試驗確定培養(yǎng)基最佳配方。

表2正交試驗因素和水平

Table2 The experimental conditions of orthogonal factors and levels

水平Level因素FactorA海藻糖/g·L-1TrehaloseB豆粕粉/g·L-1SoybeanmealpowderC硫酸鎂/g·L-1MagnesiumsulfateD磷酸二氫鉀/g·L-1Monopotassiumphosphate115250 250 25220300 500 50325350 750 75

1.2.4 子實體與液體菌絲球中功能性成分測定

將采集的子實體和液體發(fā)酵后的菌球在40 ℃的干燥箱中進行干燥72 h，直至重量不在變化，粉碎處理，測量子實體與液體菌絲球中功能性成分含量，并進行分析比對。

1.3 指標(biāo)測定

試驗中測定的主要指標(biāo)有菌球生物量、菌球的直徑、菌球萌發(fā)活力指數(shù)。

1.3.1 菌球生物量

將培養(yǎng)完成的發(fā)酵液在磁力攪拌器上充分混勻后，取50 mL在高速離心機在6 000 r·min-1下離心15 min，用40目過濾網(wǎng)過濾后，將沉淀置于60 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重測量菌球生物量并記錄。

1.3.2 菌絲生長速度

從發(fā)酵液中隨機挑取肉眼可見的10個菌球，將其放在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，統(tǒng)計平板上萌發(fā)的菌落個數(shù)并用精度為0.1 mm的數(shù)顯卡尺測菌落直徑大小，取平均值求得菌絲日生長速度。

1.3.3 菌球萌發(fā)活力的測定

A=d × C / T

式中：A為菌球萌發(fā)活力指數(shù)，d為菌落直徑，C萌發(fā)個數(shù)，T為萌發(fā)時間。

1.3.4 功能性成分測定

三萜類化合物：參照DB44/T 496-2008，以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)進行測定。

總黃酮：紫外分光光度法[13]，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)進行測定。

β-葡聚糖：熒光法進行測定[14]。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

所有試驗均為3次重復(fù)，各項指標(biāo)結(jié)果用Excel 2003作圖，Minitab l5軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同的碳源對菌球生物量、菌絲生長速度和菌球萌發(fā)活力指數(shù)的影響

由表3可見，不同的碳源對菌球的影響較大，從菌球生物量和菌絲生長速度來看，其中C1與其余四種不同的碳源培養(yǎng)基有顯著性差異，菌球生物量和菌絲生長速度最高分別為1.94 g·100 mL-1和2.44 mm·d-1，C4的最低分別為0.94 g·100 mL-1和0.26 mm·d-1。從菌球萌發(fā)活力指數(shù)看，C1的最大為2.43，菌絲萌發(fā)活性最好，C3、C5、C2次之，C4萌發(fā)活力指數(shù)最小為0.54。綜合以上分析C1作為碳源較好，菌絲萌發(fā)活力強，生長速度快，菌絲生物量高。

表3不同碳源對菌球生長狀態(tài)的影響

Table3 Effects of different carbon sources on the growth status of the mycelium pellets

編號Number碳源Carbonsource菌球生物量/g·100mL-1Mygelialbiomass菌絲生長速度/mm·d-1Growthrateofmycelium菌球萌發(fā)活力指數(shù)GerminationvigourindexofthemycelialpelletsC1海藻糖1 94±0 11a2 44±0 41a2 43±0 32aC2可溶性淀粉1 36±0 11bc1 21±0 20b1 48±0 17bC3葡萄糖1 57±0 09b1 24±0 21b2 21±0 16aC4乳糖0 94±0 06c0 26±0 04c0 54±0 18cC5蔗糖1 55±0 05b1 40±0 23b1 56±0 10b

注：表中數(shù)據(jù)后小寫字母代表0.05差異水平(下同)

Note: The lowercase letters after the data in the table represent the 0.05 difference level (the same below)

2.2 不同的氮源源對菌球生物量、菌球密度和菌球活力指數(shù)的影響

從表4知，在菌球生物量、菌絲生長速度和菌球萌發(fā)活力指數(shù)中，N1與N2無顯著差異，N1與N3、N4、N5之間存在顯著性差異；N1的菌球生物量、菌絲生長速度和菌球萌發(fā)活力指數(shù)最高分別為1.60 g·100 mL-1、2.43 mm·d-1和2.64，其中N4利用效率較低，N3為氮源時菌球在平板上并不生長，說明其有效成分很難被利用。綜合分析來看N1效果最好，N2、N5、N4次之，N3效果最差。

表4不同氮源對菌球生長狀態(tài)的影響

Table4 Effects of different nitrogen sources on the growth status of the mycelial pellets

編號Number氮源Nitrogensource菌球生物量/g·100mL-1Mygelialbiomass菌絲生長速度/mm·d-1Growthrateofmycelium菌球萌發(fā)活力指數(shù)GerminationvigourindexofthemycelialpelletsN1豆粕粉1 60±0 49a2 43±0 15a2 64±0 20aN2蛋白胨1 20±0 37ab2 01±0 17a2 47±0 08aN3尿素0 13±0 15c0 00±0 00d0 00±0 00cN4硫酸銨0 68±0 06b1 8±0 13b0 86±0 26bN5牛肉膏0 71±0 16b0 81±0 13c0 78±0 20b

2.3 不同的pH對菌球生物量、菌球密度和菌球活力指數(shù)的影響

在表5中，不同梯度的pH對菌球的影響較大，從菌球生物量看P4最高為1.58 g·100 mL-1，相比較其余4個梯度有顯著性差異，P4條件下的菌球生物量分別是P1、P3、P2、P5的2.11、 1.64、1.50、2.17倍；從菌絲生長速度看，P4與P3不存在顯著性差異，但與P1、P2、P5之間存在顯著性差異；從菌球萌發(fā)活力看，P4的活力指數(shù)最高為2.72，P1的最低為0.78，P4的萌發(fā)活力指數(shù)分別是P1、P3、P2、P5的3.48、2.40、1.25及1.40倍。綜合分析最適宜的發(fā)酵培養(yǎng)液pH是P4，依次是P3、P5、P2和P1。

表5不同pH對菌球生長狀態(tài)的影響

Table5 Effects of different pH on the growth status of the mycelial pellets

編號NumberpH菌球生物量/g·100mL-1Mygelialbiomass菌絲生長速度/mm·d-1Growthrateofmycelium菌球萌發(fā)活力指數(shù)GerminationvigourindexofthemycelialpelletsP15 00 75±0 11bc1 10±0 02c0 78±0 10dP26 00 96±0 11bc1 44±0 04bc1 13±0 11cP37 01 05±0 06b2 11±0 11ab2 17±0 11abP48 01 58±0 24a3 20±0 12a2 72±0 22aP59 00 73±0 20c1 89±0 08b1 93±0 14b

2.4 不同的接種量對菌球生物量、菌球密度和菌球活力指數(shù)的影響

從表6可以看出，菌種的接種量大小直接影響菌球的生物量、菌絲生長速度和菌球的萌發(fā)活力。J2在菌絲生長速度上和菌球萌發(fā)活力指數(shù)上最好分別為3.82 mm·d-1和2.97，但是菌絲生物量太少為1.46 g·100 mL-1，可能是由于接種量小，發(fā)酵液營養(yǎng)液比較豐富導(dǎo)致J2的菌球營養(yǎng)利用空間大，菌球活力較強，菌絲生物量較少。J4在菌球生物量上含量最高為2.28 g·100 mL-1，J4與J2菌絲的萌發(fā)活力指數(shù)有顯著性差異，這說明接種量的太大了可能導(dǎo)致菌球萌發(fā)的減弱。

表6不同接種量對菌球生長狀態(tài)的影響

Table6 Effects of different inoculum concentrations on the growth status of the mycelial pellets

編號Number接種量/%Inoculumconcentrations菌球生物量/g·100mL-1Mygelialbiomass菌絲生長速度/mm·d-1Growthrateofmycelium菌球萌發(fā)活力指數(shù)GerminationvigourindexofthemycelialpelletsJ15%0 85±0 02b2 13±0 06ab2 63±0 03abJ28%1 46±0 01b3 82±0 12a2 97±0 01aJ311%1 70±0 07ab2 89±0 04ab2 61±0 04abJ414%2 28±0 05a2 27±0 14ab2 26±0 12bJ517%2 05±0 06ab0 81±0 03c1 82±0 08c

2.5 不同的培養(yǎng)溫度對菌球生物量、菌球密度和菌球活力指數(shù)的影響

從表7可知，不同的培養(yǎng)溫度對菌球的各項指標(biāo)影響不同，菌絲在T1-T5五個梯度之間都可以生長，菌球生物和菌球萌發(fā)活力指數(shù)在T3時最高分別為1.75 g·100 mL-1和2.79，T3時菌絲生長速度最快為0.31 mm·d-1，T2與T3在菌絲生長速度和菌球生物量上沒有顯著性差異，表明有利于發(fā)酵培養(yǎng)液的溫度最適宜的為T3，其余的順序以此為：T2>T4>T1>T5。

2.6 主要營養(yǎng)因素對菌球生物量影響的正交試驗

由表8可知，在4個因素之中，對菌球生物量影響程度的大小排列依次為A(海藻糖)>B(豆粕粉)>D(KH2PO4)>C(MgSO4)，碳源的極差為0.47，氮源的極差為0.26，表明其中碳源和氮源的為主要影響因素。最佳培養(yǎng)基配方組合為A2B3C1D2。從正交試驗結(jié)果來看，高產(chǎn)菌球生物量最高培養(yǎng)基配方為海藻糖20 g·L-1、豆粕粉35 g·L-1、KH2PO40.5 g·L-1和MgSO40.25 g·L-1。

表7不同培養(yǎng)溫度對菌球生長狀態(tài)的影響

Table7 Effects of different incubation temperature on the growth status of the mycelial pellets

編號Number培養(yǎng)溫度/℃Incubationtemperature菌球生物量/g·100mL-1Mygelialbiomass菌絲生長速度/mm·d-1Growthrateofmycelium菌球萌發(fā)活力指數(shù)GerminationvigourindexofthemycelialpelletsT1211 11±0 08b0 23±0 01b1 87±0 13cT2241 52±0 04a0 30±0 03a2 34±0 24bT3271 75±0 09a0 31±0 02a2 79±0 15aT4301 50±0 19a0 22±0 02b2 08±0 13bcT5330 90±0 18b0 10±0 01c0 74±0 12d

表8 正交試驗結(jié)果直觀分析表Table 8 The result and range analysis of orthogonal testing

2.7 驗證試驗

試驗的培養(yǎng)基配方：海藻糖20 g·L-1、豆粕粉35 g·L-1、KH2PO40.5 g·L-1、MgSO40.25 g·L-1、VB1100 μg·L-1、VB2500 μg·L-1，培養(yǎng)條件溫度27 ℃、起始pH為8.0、接種量為11 %為培養(yǎng)基配方，該條件下作為優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方，進行驗證試驗。結(jié)果顯示，菌球生物量為2.36 g·100 mL-1與試驗值相對誤差為2.48 %，說明該正交試驗合理可靠。

2.8 子實體與液體菌絲球中功能性成分分析

由表9可知，按照正交設(shè)計優(yōu)化后產(chǎn)出的液體菌絲體與該菌的子實體的功能成分含量相差比較大，發(fā)酵菌絲體中三萜類化合物含量是子實體中的4.66倍，黃酮含量是子實體中的25.80 倍，β-葡聚糖含量是子實體中的2.38倍，相對與新鮮子實體，液體菌絲體的有效功能成分含量更高，為該菌的液體發(fā)酵技術(shù)開發(fā)研究奠定了理論基礎(chǔ)。

表9子實體中和發(fā)酵菌絲體中的功能性成分含量

Table9 The content of functional components in the fruiting body and the fermented mycelium

功能性成分Functionalcomponent子實體Ediblefungus液體菌絲體Liquidmycelium三萜類化合物/mg·100g-1120559黃酮/mg·100g-16 59170β?葡聚糖/mg·g-113 431 78

3 討論與結(jié)論

嗜藍孢孔菌新種FomitiporiayanbeiensisS. Guo & L. Zhou 是一種珍稀的食藥用真菌，含有豐富的三萜、黃酮、多糖等有益成分，本文對其液體發(fā)酵工藝進行優(yōu)化培養(yǎng)，篩選最佳培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基配方，以提高發(fā)酵菌球生物量替代野生野生資源的開采。

在試驗測試中，微小的菌絲球不容易觀察計數(shù)，因此試驗并未將菌球密度作為指標(biāo)來衡量，而是將菌球生物量、菌球萌發(fā)活力指數(shù)和菌絲生長速度為主要技術(shù)指標(biāo)進行優(yōu)化培養(yǎng)，更加真實體現(xiàn)菌球的萌發(fā)活力。在碳源試驗中發(fā)現(xiàn)海藻糖相比其它的4種碳源更容易被吸收利用，可能是因為海藻糖在惡劣環(huán)境條件下可以在細胞表面能形成獨特的保護膜，維持細胞完整性和保護細胞[15]，導(dǎo)致在發(fā)酵后期菌球仍有很好的活性。不同的氮源單因素試驗結(jié)果表明用豆粕粉更有利于形成菌球，這有可能是豆粕粉在液體發(fā)酵高溫滅菌后發(fā)生了糊化作用，增加了培養(yǎng)基的粘度，有利于菌物分散形成菌球，這與董玉蘭[8]等在白靈菇高活力液體菌種培養(yǎng)條件的研究中一致。在不同的pH試驗中篩選的最始pH為8.0，相對于郭尚[16]等研究的最適pH較高，孟澤彬[17]等在研究古尼蟲草胞內(nèi)多糖高產(chǎn)培養(yǎng)基優(yōu)化研究認(rèn)為發(fā)酵液的pH在最初發(fā)酵的72 h內(nèi)下降很快，導(dǎo)致的最適起始pH較高，也有能是該種采集于鹽堿地域，其土壤pH比較高，從而導(dǎo)致其最適pH比較高，至于是環(huán)境因素還是發(fā)酵培養(yǎng)的影響，還有待進一步考察研究。試驗中也發(fā)現(xiàn)接種量多少能夠直接影響發(fā)酵的菌球生物量，接種量為11 %時菌球萌發(fā)快和菌球生物量高。FomitiporiayanbeiensisS. Guo & L. Zhou也具有較廣的生長溫度，21～33 ℃均可生長，最適宜的是27 ℃與郭尚[16]等研究的基本一致。在子實體與液體菌絲球中功能性成分分析中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵菌絲體中三萜類化合物、黃酮和β-葡聚糖的含量分別是子實體中的4.66倍、25.80倍和2.38倍，液體菌絲體比新鮮子實體的功能性成含量高，這也為該菌的液體發(fā)酵技術(shù)開發(fā)研究奠定了理論基礎(chǔ)。

發(fā)酵工藝的優(yōu)化是提高FomitiporiayanbeiensisS. Guo & L. Zhou菌球生物量最有的效途徑，以該菌的功能性成分為測量指標(biāo)，分析和建立溫度、接種量、轉(zhuǎn)速和灌裝量共同作用的交互模型是今后工作的重點研究方向，與此同時也應(yīng)該加強該菌株的菌種抗性的研究。

試驗通過單因素試驗和正交試驗對嗜藍孢孔菌新種FomitiporiayanbeiensisS. Guo & L. Zhou的液體菌種培養(yǎng)條件進行優(yōu)化研究，結(jié)果顯示：(1)最佳的碳源是海藻糖，最適的氮源是豆粕粉，最適的培養(yǎng)溫度27 ℃，最適起始pH為8.0，最適的接種量為11 %。(2)最佳培養(yǎng)基組合是：海藻糖20 g·L-1、豆粕粉35 g·L-1、KH2PO40.5 g·L-1、MgSO40.25 g·L-1，用該培養(yǎng)基可獲得菌球生物量2.36 g·100 mL-1，相比較優(yōu)化前增加了1.39倍。

參 考 文 獻

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