亓麗紅，黃 兵，吳家強(qiáng)，宋玲玲，王友令，馬秀麗，于可響，劉 濤，艾 武，徐懷英

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 家禽研究所，山東 濟(jì)南 250023)

雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起雞急性高度接觸性傳染病，以呼吸道癥狀、蛋種雞產(chǎn)蛋量下降、蛋品質(zhì)下降、腎臟病變及胃腸炎變化為主要特征，是目前危害國(guó)際養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一。由于IBV血清型多，且新的血清型不斷涌現(xiàn)，而各型間交叉保護(hù)率低，新的變異株不斷出現(xiàn)，組織嗜性也多變，給診斷和防治帶來(lái)一定困難[1-5]。

IBV含有3種結(jié)構(gòu)蛋白，即纖突蛋白S、膜蛋白M和核衣殼蛋白N。N蛋白占病毒總蛋白量的40%，主要作用是包裹核酸，與病毒的復(fù)制有關(guān)[6]。N蛋白還能免疫識(shí)別相關(guān)靶位，在細(xì)胞免疫和體液免疫中起作用。在進(jìn)化過(guò)程中N蛋白比S1蛋白相對(duì)保守，因此我們通過(guò)對(duì)N蛋白進(jìn)行表達(dá)，以此作為群特異性診斷抗原，建立了檢測(cè)不同IBV抗體水平的間接ELISA診斷試劑盒。自建試劑盒選擇原核表達(dá)載體pET-32 a(+)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行融合表達(dá)并純化，解決了IBV全病毒純化困難的問(wèn)題。檢測(cè)雞傳染性支氣管炎病毒抗體的間接ELISA試劑盒，成本低廉、操作簡(jiǎn)便、快速，尤其適合批量樣品的檢測(cè)，大大提高了雞傳染性支氣管炎血清學(xué)診斷的效率[7-10]。

1 材料與方法

1.1 病毒、試劑及藥品

IBV-LC2、表達(dá)載體pET32 a、大腸桿菌BL21均為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所禽病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。限制性?xún)?nèi)切酶SalⅠ、EcoRⅤ及Trizol RNA提取試劑購(gòu)自TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、RNA酶抑制劑及dNTP混合物購(gòu)自Promage公司；酶標(biāo)HRP-羊抗雞IgG(工作濃度為1∶3 000)購(gòu)自SouthernBiotech公司；rTaqDNA聚合酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；IBV ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自IDEXX公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 IBV N蛋白的擴(kuò)增及重組表達(dá)載體的構(gòu)建

參照GenBank已公布的IBV-LC2N基因(DQ377139)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，正鏈引物為5′-CCGATATCATGGCAAGCGGTAAAGCA-3′(EcoRⅤ位點(diǎn))，負(fù)鏈引物為5′-CCGTCGACACTC AAAGTTCATTCTCTCC-3′(SalⅠ位點(diǎn))，擴(kuò)增片段大小為1 230 bp。引物合成由生工生物工程(上海)有限公司完成。提取核酸，進(jìn)行RT-PCR。PCR循環(huán)參數(shù)為：94 ℃變性2 min后，經(jīng)94 ℃ 1 min，50 ℃ 60 s，72 ℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)，最后于72 ℃延伸10 min。將載體pET32 a和PCR產(chǎn)物進(jìn)行EcoR V、SalⅠ雙酶切并回收。用T4 DNA連接酶將二者進(jìn)行16 ℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌感受態(tài)細(xì)菌BL21，37 ℃溫箱培養(yǎng)16～20 h。挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用EcoR V、SalⅠ進(jìn)行雙酶鑒定。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送上海博亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒在宿主菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將鑒定為陽(yáng)性的重組菌接種于4 mL LB(含100 μg·mL-1Amp)試驗(yàn)培養(yǎng)基中，待37 ℃振蕩過(guò)夜，取出1 mL，離心，去上清，菌體接種于100 mL含Amp的 LB(100 μg·mL-1)培養(yǎng)基中。37 ℃ 200 r·min-1振蕩培養(yǎng)至D600=0.6，加IPTG至終濃度為1.0 mmol·L-1，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)至4 h，10 000 r·min-1離心5 min,收集菌體，加適量裂解緩沖液，于冰浴中超聲破碎，10 000 r·min-1離心5 min，收集上清。加入等體積SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸3～5 min。每孔上樣15 μL，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。用染色液 R-250染色，后放入脫色液中脫色。

1.4 表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot檢測(cè)

將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，待電泳分離后，切出含待轉(zhuǎn)膜蛋白的凝膠轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。用含10%小牛血清的PBST洗液浸泡硝酸纖維膜，37 ℃封閉2 h。用洗液1∶100倍稀釋雞抗IBV陽(yáng)性血清，將硝酸纖維素膜浸泡其中，反應(yīng)1 h，洗液洗膜3次，每次5 min。加入新配置的DAB顯色液，避光反應(yīng)15 min。顯色完成后，將硝酸纖維素膜移至蒸餾水中終止顯色。

1.5 表達(dá)的融合蛋白的純化

按照His-Bind蛋白純化柱使用說(shuō)明進(jìn)行表達(dá)蛋白的純化。將破碎好的重組菌進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后取下凝膠，先用雙蒸水洗滌，然后浸入4 ℃預(yù)冷的250 mmol·L-1的KCl溶液中顯色5～10 min，最后用雙蒸水洗滌。將目的蛋白條帶切下，放入2 mL的Eppendorf管中，加少量的PBS洗滌數(shù)次，加少量的PBS，用玻璃棒將其搗細(xì)，反復(fù)凍融數(shù)次，8 000 r·min-1離心10 min，吸取上清，SDS-PAGE電泳進(jìn)行純度鑒定，核酸蛋白分析儀測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證后將純化后的蛋白分裝放入-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 間接ELISA最佳工作濃度及臨界值的確定

用包被緩沖液將IBV N重組蛋白進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)籈LISA反應(yīng)板，每孔80、40、20、10、5、2.5 μg·mL-1包被ELISA反應(yīng)板，IBV陽(yáng)性血清和陰性血清經(jīng)大腸桿菌裂解液處理后分別作1∶25，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800系列稀釋?zhuān)贿M(jìn)行間接ELISA測(cè)定。TMB底物顯色，硫酸終止反應(yīng)；測(cè)定光波長(zhǎng)450 nm的D值。在最佳工作條件下，對(duì)收集的20份無(wú)IBV抗體雞血清進(jìn)行間接ELISA測(cè)定，確定陰陽(yáng)性臨界值。

1.7 間接ELISA的特異性、重復(fù)性試驗(yàn)和抗原保存期試驗(yàn)

用IBV-N蛋白建立的間接ELISA方法分別檢測(cè)NDV、AIV、EDS-76、IBDV、ILTV等陽(yáng)性血清及IBV陰性血清進(jìn)行交叉反應(yīng)性測(cè)定，每樣本2個(gè)重復(fù)。用2次包被的酶標(biāo)板，檢測(cè)10份IBV陽(yáng)性血清和10份陰性血清，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)5次，測(cè)定其變異系數(shù)。純化的重組N蛋白以最佳工作濃度包被封閉后，待其干燥后裝入含干燥劑的包裝袋中4 ℃保存，后隔12個(gè)月取出用已知陰陽(yáng)性血清按所建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 與IDEXX公司的ELISA試劑盒檢測(cè)的對(duì)比

臨床應(yīng)用檢驗(yàn)的樣品80份。應(yīng)用自制ELISA試劑盒和進(jìn)口IDEXX試劑盒同時(shí)檢測(cè)送檢樣品，比較試劑盒的符合率。

1.9 間接ELISA方法的初步應(yīng)用

將免疫雛雞所孵出的12日齡的雛雞分別在免疫前、免疫H120后5、9、21和28 d采血，分離血清，間接ELISA測(cè)定，分析母源抗體的消長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體的構(gòu)建

陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)EcoR V、SalⅠ雙酶切產(chǎn)生5.9 kb的載體條帶和約1.23 kb的外源基因片段。并將陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒命名為PET32 a-LC2-N。結(jié)果見(jiàn)圖1。測(cè)序結(jié)果顯示插入方向正確，插入片斷為 1 230個(gè)核苷酸，編碼410個(gè)氨基酸。推測(cè)IBV-LC2-N蛋白分子量為45.1 ku，融合伴侶分子量為20.4 ku，整個(gè)表達(dá)融合蛋白為65.5 ku。

1為EcoR V、SalⅠ雙酶切質(zhì)粒pET-LC2-N；2為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；3為EcoR V、SalⅠ雙酶切質(zhì)粒pET-LC2-N；4為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)圖1 pET32 a-LC2-N重組質(zhì)粒酶切鑒定的結(jié)果

2.2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE與Western-blotting分析

將含有陽(yáng)性重組載體的大腸桿菌在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)，產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE檢測(cè)，在大約65 ku處可見(jiàn)表達(dá)條帶，與預(yù)期蛋白大小相一致，而空載體菌誘導(dǎo)后，沒(méi)有出現(xiàn)此蛋白條帶(圖2)。將目的蛋白進(jìn)行純化(圖3)。Western-blotting分析發(fā)現(xiàn)該融合蛋白能與雞抗IBV陽(yáng)性血清進(jìn)行反應(yīng)，具有良好的免疫原性，確定了65.5 ku的蛋白為重組的N蛋白(圖4)。

1為pET-32 a誘導(dǎo)表達(dá)4 h；2～6為pET-32 a-IBV-N-BL21誘導(dǎo)表達(dá)4 h；7 為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)圖2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

1為純化的重組蛋白；2為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；3～6為純化的重組蛋白圖3 重組蛋白的純化

1為重組蛋白；2為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；3為pET-32(+)空載體圖4 重組蛋白的Western-blot 檢測(cè)

2.3 間接ELISA最佳工作濃度及臨界值的確定

間接ELISA方陣實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1)取陽(yáng)性血清D450在1.0左右，陰性血清D450在 0.297左右，且陽(yáng)性血清D450/陰性血清D450即P/N值大于2.1的抗原濃度和血清稀釋度為最佳工作濃度，結(jié)果如表1所示。從表1～2可以看出，抗原最佳濃度為20 μg·mL-1，血清最佳稀釋濃度為1∶200。

2.4 間接ELISA的特異性、重復(fù)性試驗(yàn)和抗原保存期的確定

用IBV-N蛋白建立的間接ELISA方法分別檢測(cè)NDV、AIV、EDS-76、IBDV、ILTV等陽(yáng)性血清及IBV陰性血清進(jìn)行交叉反應(yīng)性測(cè)定，結(jié)果均為陰性，表明該方法與上述病毒無(wú)交叉反應(yīng)。用2次包被的酶標(biāo)板，檢測(cè)10份IBV陽(yáng)性血清和10份陰性血清，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)5次，測(cè)定其變異系數(shù)結(jié)果表明，變異系數(shù)最大為4.80%，最小為0.8%。20份血清變異系數(shù)都較小，具有較好的重復(fù)性。隔12個(gè)月取出用已知陰陽(yáng)性血清按所建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，包被本發(fā)明的重組N蛋白保存12個(gè)月仍可用于檢測(cè)。

表1 不同抗原包被量和血清稀釋度對(duì)D450值的影響

注：P代表陽(yáng)性血清；N代表陰性血清。

表2 不同抗原包被量和血清稀釋度對(duì)P/N值的影響

2.5 自制ELISA試劑盒與中和進(jìn)口IDEXX試劑盒的對(duì)比

臨床應(yīng)用檢驗(yàn)的樣品80份。應(yīng)用自制ELISA試劑盒和進(jìn)口IDEXX試劑盒同時(shí)檢測(cè)送檢樣品，比較試劑盒的符合率。其中自制ELISA試劑盒檢出陽(yáng)性血清為50份，陽(yáng)性檢出率為62.5%，進(jìn)口IDEXX試劑盒檢出陽(yáng)性血清47份，陽(yáng)性檢出率為58.75%，2種方法的符合率為96.25%(表3)。

表3 血清樣品的檢測(cè)結(jié)果與IDEXX公司的ELISA試劑盒比較

2.6 間接ELISA方法的應(yīng)用

用該試劑盒對(duì)雛雞免疫 IBV H120前及免疫后5、9、21及28 d雞的抗體滴度進(jìn)行檢測(cè)，免疫7 d后開(kāi)始出現(xiàn)免疫抗體，然后抗體水平不斷升高，到21 d抗體水平達(dá)到最高峰，隨后抗體水平逐漸下降，28 d時(shí)抗體檢測(cè)為陽(yáng)性，抗體持續(xù)到28日齡(圖5)。

圖5 SPF雛雞免疫后抗體的消長(zhǎng)規(guī)律

3 小結(jié)與討論

IBV核衣殼蛋白又稱(chēng)核蛋白(N蛋白)，具有很好的抗原性和免疫原性，在細(xì)胞免疫和體液免疫中起著重要作用。體外表達(dá)的N蛋白能引起免疫應(yīng)答，能使免疫雞增速產(chǎn)生抗IBV抗體，可誘導(dǎo)雞對(duì)IBV氣管感染的免疫保護(hù)作用。用N蛋白免疫雞后，可激活T輔助細(xì)胞，同時(shí)可增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力。加上N蛋白具有高保守性，這使得N蛋白及其抗體在IBV診斷方面顯示出優(yōu)勢(shì)。核蛋白占病毒總蛋白量大，而且核蛋白為非糖基化蛋白，由于它能檢測(cè)群抗體應(yīng)答，可以作為IBV群特異性診斷抗原。本研究在利用RT-PCR成功獲得了IBVN基因的基礎(chǔ)上，利用原核表達(dá)載體pET-32 a成功地表達(dá)了N蛋白，并證實(shí)了其具有良好的反應(yīng)原性。以此重組N蛋白建立了N-ELISA，經(jīng)特異性、重復(fù)性試驗(yàn)證實(shí)了建立的N-ELISA具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

通過(guò)自制試劑盒來(lái)檢測(cè)免疫H120的IBV抗體消長(zhǎng)變化，可知，在免疫7 d后，機(jī)體開(kāi)始產(chǎn)生抗體，然后抗體水平不斷升高，到21 d抗體水平達(dá)到最高峰，隨后抗體水平逐漸下降，抗體持續(xù)到28 d，符合IBV弱毒疫苗抗體的消長(zhǎng)規(guī)律，說(shuō)明該試劑盒的檢測(cè)結(jié)果可以適用于IBV免疫后的抗體水平檢測(cè)。自制試劑盒的包被抗原區(qū)別于IDEXX的包被抗原IBV。自建試劑盒檢測(cè)血清時(shí)做200稀釋。IDEXX試劑盒檢測(cè)樣品時(shí),血清樣品是做500倍稀釋?zhuān)眠@2種方法對(duì)80份血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，比較它們的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自建試劑盒檢測(cè)D值普遍都比IDEXX試劑盒的D值高。出現(xiàn)這樣的差異可能是由于血清稀釋度不同造成的，也可能與2種試劑盒的包被抗原不同有關(guān)。通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明自制試盒質(zhì)量可靠，結(jié)果確實(shí)，是一種敏感、快速的臨床檢測(cè)方法。但自制試劑盒其成本低，可以用于大批量檢測(cè)，是我們急需研制的國(guó)產(chǎn)同類(lèi)試劑盒，以提高我國(guó)對(duì)IBV的檢測(cè)水平[8,11]。

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