姚金曉，楊 飛，王呈陽(yáng)，楊梢娜，吳海平，莊葉軍*

(1.舟山市農(nóng)林科學(xué)研究院 316000； 2.舟山市農(nóng)林技術(shù)推廣中心 316000)

日光溫室早春或者越冬栽培，因溫度較低，農(nóng)作物常造成生理障礙或結(jié)實(shí)器官受損，導(dǎo)致冷害現(xiàn)象的發(fā)生，最終導(dǎo)致農(nóng)作物不能正常生長(zhǎng)而降低產(chǎn)量，甚至?xí)斐山^產(chǎn)[1-2]?？茖W(xué)工作者為了解決冷害對(duì)多種植物的影響，進(jìn)行了一系列的研究。吳雪霞等[3]研究低溫處理的5份茄子材料，發(fā)現(xiàn)其生物量積累受到顯著抑制，耐低溫材料的抑制程度小于低溫敏感材料。馬艷青等[4]對(duì)不同品種的辣椒進(jìn)行低溫處理后，發(fā)現(xiàn)丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)與辣椒的抗寒性密切相關(guān)。朱文哲等[5]研究發(fā)現(xiàn)較耐低溫的多毛番茄的MDA含量均顯著低于普通番茄，而SOD活性等酶活性則顯著高于普通番茄。包崇來(lái)等[6]采用低溫處理100份茄子資源，篩選得到耐低溫材料和敏感材料各一份，并對(duì)其生理響應(yīng)進(jìn)行了研究。目前對(duì)于大多數(shù)蔬菜，科研工作者進(jìn)行了耐低溫脅迫試驗(yàn)，并篩選到了一些寶貴的耐低溫材料，并且有的進(jìn)行了生理生化研究。但是對(duì)于冬瓜的耐低溫材料的篩選及耐低溫生理響應(yīng)研究國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)道。

為此本試驗(yàn)利用低溫脅迫冬瓜幼苗，分析幼苗的冷害指數(shù)，形態(tài)指標(biāo)以及生理生化指標(biāo)的變化，進(jìn)行耐低溫響應(yīng)的研究；并用聚類分析的方法，進(jìn)行耐低溫的冬瓜種質(zhì)材料的篩選。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的23 份冬瓜材料中，13份為市場(chǎng)收集品種，5份自主選育純合材料，5份自主雜交組合。試驗(yàn)于 2016—2017年在舟山市農(nóng)林科學(xué)院的人工氣候室中進(jìn)行。

供試材料的來(lái)源名稱及代碼。1，玲瓏秀色4號(hào)，長(zhǎng)沙市銀田蔬菜種子實(shí)業(yè)有限公司；2，01-1-5-9-10-1-5；3，嫩仔，鼎牌種苗有限公司；4，55-1-2-6-6-4×04-5-7-5-8-5；5，07-1-3-11-5-1；6，玲瓏秀色1號(hào)，長(zhǎng)沙市銀田蔬菜種子實(shí)業(yè)有限公司；7，55-1-2-6-9-1×04-2-7-5-5-6；8，粉娃；9，碧玉2號(hào)；10，55-1-2-6-9-1；11，04-5-7-5-8-5；12，55-1-2-6-6-4；13，冠玉，廣州乾農(nóng)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司；14，碧玉1號(hào)；15，水果冬瓜，北京花兒朵朵花仙子農(nóng)業(yè)有限公司；16，F(xiàn)0055×04-5-7-5-8-5；17，泰美小冬瓜，重慶圣華種業(yè)有限公司；18，04-5-7-5-8-5×F0060；19，55-1-2-6-9-1×04-5-7-5-8-5；20，碧玉節(jié)瓜，成都良慶園農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司；21，綠娃；22，白星102，湖南興蔬種業(yè)有限公司；23，芋香小冬瓜，廣東省良種引進(jìn)服務(wù)公司。 其中2、4、5、7、10、11、12、16、18和19都是來(lái)自舟山市農(nóng)林科學(xué)院自選育材料或者雜交組合。8、9、14和21來(lái)自南寧桂福園農(nóng)業(yè)有限公司。

1.2 方法

冬瓜種子置于28 ℃恒溫箱內(nèi)催芽，待發(fā)芽時(shí)，將種子播種到32孔穴盤中，正常管理。當(dāng)冬瓜幼苗長(zhǎng)至2葉1心時(shí)，選取形態(tài)及長(zhǎng)勢(shì)基本一致的幼苗直接放入人工氣候箱中進(jìn)行低溫脅迫處理。溫度為(12±1)℃/(6±1)℃ (晝/夜)，連續(xù)處理7 d[7]，每個(gè)品種處理8株，另外各個(gè)材料設(shè)對(duì)照組，溫室大棚內(nèi)，自然生長(zhǎng)，分別設(shè)3 次重復(fù)。在低溫脅迫結(jié)束后，對(duì)處理組和對(duì)照組進(jìn)行冷害指數(shù)、形態(tài)指標(biāo)、生理生化指標(biāo)的測(cè)定。冷害指數(shù)的測(cè)定參照姜述君等標(biāo)準(zhǔn)[8]，電導(dǎo)率的測(cè)定參照郝再彬等方法[9]。SOD、APX、MDA采用蘇州科名的試劑盒進(jìn)行。運(yùn)用軟件SPSS 19.0分析，并用系統(tǒng)聚類法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果用樹(shù)狀圖表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬瓜幼苗品種間冷害指數(shù)的差異

對(duì)23份材料的冷害指數(shù)進(jìn)行方差分析。表1表明，低溫脅迫對(duì)不同品種冬瓜幼苗冷害指數(shù)表現(xiàn)不一。本試驗(yàn)中將冷害指數(shù)<2.0的材料定為強(qiáng)耐冷型，將冷害指數(shù)在2.1～3.0的材料定為弱耐冷型，將冷害指數(shù)>3.0的材料定為冷敏感型。冷敏感型的材料有2、13、9、4、6、23、8、14、22、17和5；強(qiáng)耐冷型材料有11、10、15、16、19和20。其余材料為弱耐冷型。

表1 23份冬瓜材料的冷害指數(shù)及耐低溫性

2.2 低溫脅迫對(duì)冬瓜幼苗形態(tài)指標(biāo)的影響

如圖1～5所示，23份冬瓜材料在低溫脅迫后，各材料的5個(gè)形態(tài)指標(biāo)處理組與對(duì)照組相比，均呈下降趨勢(shì)，不同的材料下降幅度不一致，說(shuō)明冬瓜植株在受冷害脅迫后，形態(tài)發(fā)生變化，各品種間變化差異明顯。

圖1 低溫脅迫對(duì)冬瓜幼苗株高的影響

圖2 低溫脅迫對(duì)冬瓜幼苗莖粗的影響

圖3 低溫脅迫對(duì)冬瓜幼苗葉面積的影響

圖4 低溫脅迫對(duì)冬瓜幼苗鮮物質(zhì)量的影響

圖5 低溫脅迫對(duì)冬瓜幼苗干物質(zhì)量的影響

從株高指標(biāo)來(lái)看，4、5、8、18、21和23屬于冷敏感型材料，材料1、7、13、14、15、17、19、20和22屬于強(qiáng)耐冷型材料；從莖粗指標(biāo)看，4、5、8、12、21和23屬于冷敏感型材料，1、7、10、13、14、16、19、20和22屬于強(qiáng)耐冷型材料；從葉面積指標(biāo)看，3、4、5、6、8、16、18和23屬于冷敏感型材料，12、13、15、17、20和22屬于強(qiáng)耐冷型材料；從鮮物質(zhì)量指標(biāo)看，1、3、5、6、16、18和23屬于冷敏感型材料，屬于最敏感材料，2、11、13、14、15、20和22屬于強(qiáng)耐冷型材料。從干物質(zhì)量指標(biāo)看，1、3、5、6、16、18和23屬于冷敏感型材料，2、11、13、1415、20和22屬于強(qiáng)耐冷型材料。

2.3 低溫脅迫對(duì)冬瓜幼苗生理生化的影響

如圖6～9所示，23份冬瓜材料在低溫脅迫后，各材料生理生化指標(biāo)的處理組與對(duì)照組相比，都呈上升趨勢(shì)，不同的材料上升幅度不一致，說(shuō)明冬瓜植株在受冷害脅迫后，生理發(fā)生了變化，各品種間變化差異明顯。

植物細(xì)胞受到冷害脅迫越重，細(xì)胞膜受到傷害越大，導(dǎo)致其通透性變大，滲出的物質(zhì)增多，表現(xiàn)為電導(dǎo)率就越大[10]。因此，從電導(dǎo)率指標(biāo)看，5、11、13、14、16、17、22和23屬于冷敏感型材料，1、7、10、12、20和21屬于強(qiáng)耐冷型材料；SOD起到清除植物體內(nèi)過(guò)氧離子的作用，有效防止對(duì)植物體的損害[11]，當(dāng)植物細(xì)胞受到冷害脅迫時(shí)，SOD含量就會(huì)增加，因此從SOD活性指標(biāo)看，1、3、5、6、12、15、16、17、19和23屬于冷敏感型材料，7、8、9、18、20和22屬于強(qiáng)耐冷型材料；MDA是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷[12]，在植物衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是一個(gè)常用指標(biāo)，因此從MDA活性指標(biāo)看，1、2、4、5、12、13和14屬于冷敏感型材料，8、10、11、15、21和23屬于強(qiáng)耐冷型材料；APX是植物活性氧代謝中重要的抗氧化酶之一，可以有效清除葉綠體中的H2O2，是抗性生理研究中一個(gè)常用指標(biāo)[13]。因此，從APX活性指標(biāo)看，5、8、9、10、11、12、16、21和23屬于冷敏感型材料，4、7、13、14、15、17、18和20屬于強(qiáng)耐冷型材料。

圖6 低溫脅迫對(duì)冬瓜幼苗電導(dǎo)率的影響

圖7 低溫脅迫對(duì)冬瓜幼苗SOD活性的影響

圖8 低溫脅迫對(duì)冬瓜幼苗MDA活性的影響

圖9 低溫脅迫對(duì)冬瓜幼苗APX活性的影響

2.4 應(yīng)用形態(tài)學(xué)指標(biāo)對(duì)冬瓜幼苗進(jìn)行耐低溫評(píng)價(jià)

通過(guò)對(duì)低溫脅迫后得到的形態(tài)學(xué)指標(biāo)聚類，對(duì)23份冬瓜材料進(jìn)行耐冷性分析(圖10)。遺傳距離為5時(shí)，可以將23份冬瓜材料分為3個(gè)類群。第1個(gè)類群17個(gè)，10、11、1、19、7、22、16、12、20、15、17、14、6、9、4、13和21，占總材料的73.9%同。第2類群4個(gè)，2、8、23、18，占總材料的17.4%。第3類群2個(gè)，3和5，占總材料的8.7%。

圖10 形態(tài)學(xué)指標(biāo)聚類分析

2.5 生理生化指標(biāo)對(duì)冬瓜幼苗進(jìn)行耐低溫評(píng)價(jià)

通過(guò)對(duì)低溫脅迫后得到的生理生化指標(biāo)聚類，對(duì)23份冬瓜材料進(jìn)行耐冷性分析(圖11)。遺傳距離為13時(shí)，可以將23份冬瓜材料分為3個(gè)類群。第1個(gè)類群6個(gè)，分別為3、19、1、12、6和15,占總材料的26.1%；第2類群8個(gè)，分別為8、9、4、18、10、21、7和20，占總材料的34.8%；第3類群9個(gè)，分別為16、17、23、14、5、2、11、22和13，占總材料的39.1%。

圖11 生理生化聚類分析

2.6 不同耐低溫評(píng)價(jià)方式結(jié)果分析

雖然單一指標(biāo)也還能反映不同冬瓜品種的耐低溫強(qiáng)弱，但每個(gè)指標(biāo)的結(jié)果完全不一致，因此利用多個(gè)指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)會(huì)更加精確。本試驗(yàn)利用不同耐低溫評(píng)價(jià)方式，包括冷害指數(shù)評(píng)價(jià)、形態(tài)學(xué)指標(biāo)聚類和生理生化指標(biāo)聚類，可得到結(jié)果如表2所示。

表2 不同耐低溫評(píng)價(jià)方式的結(jié)果

從表2中可知，冷害指數(shù)評(píng)價(jià)、形態(tài)學(xué)指標(biāo)聚類評(píng)價(jià)、生理生化指標(biāo)聚類評(píng)價(jià)三者比較，雖然結(jié)果有一定差異性，但存在相同的材料。三種評(píng)價(jià)方式可篩選到重合的冬瓜材料：冷敏感材料5，強(qiáng)耐冷型材料15和19。

3 討論

由于對(duì)冬瓜的耐低溫研究報(bào)道較少，對(duì)相關(guān)的研究比較只能與相近的葫蘆科植物做對(duì)比分析。本研究中，冬瓜苗期在低溫脅迫后，形態(tài)指標(biāo)和生理生化指標(biāo)都會(huì)產(chǎn)生不同的響應(yīng)，不同的冬瓜材料變化不同。冬瓜幼苗時(shí)期的株高、莖粗、葉面積、鮮物質(zhì)量和干物質(zhì)量均呈下降趨勢(shì)；電導(dǎo)率、MDA含量、SOD活性和APX活性，均呈增加趨勢(shì)。冬瓜幼苗低溫脅迫后，株高、莖粗、葉面積、鮮物質(zhì)量和干物質(zhì)量的變化與李琦[14]對(duì)甜瓜幼苗的研究結(jié)果有相似性。冬瓜苗期在低溫脅迫后，其電導(dǎo)率和MDA的變化與楊艷等[15]對(duì)西瓜的低溫脅迫研究結(jié)果一致；冬瓜苗期的SOD活性變化與李明玉等[16]對(duì)葫蘆科植物黃瓜的低溫脅迫研究結(jié)果基本一致；冬瓜苗期的APX活性變化與趙春梅等[17]對(duì)薄皮甜瓜耐低溫研究結(jié)果一致。因此，以上指標(biāo)都可以作為測(cè)量幼苗受低溫影響的指標(biāo)。

對(duì)于一些低溫脅迫資源材料的篩選，一些科研工作者僅僅采用生理指標(biāo)或者形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行篩選。高青海等[18]對(duì)20份薄皮甜瓜進(jìn)行低溫弱光處理，測(cè)定了薄皮甜瓜幼苗的株高、莖粗、地上部鮮質(zhì)量、根系鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、根系干質(zhì)量、葉片數(shù)、根長(zhǎng)、根表面積、根體積、根尖數(shù)、根投影面積等12個(gè)形態(tài)指標(biāo)，通過(guò)聚類分析篩選出7個(gè)耐低溫弱光脅迫強(qiáng)的品種和1個(gè)不耐低溫弱光品種。王亞坤等[19]通過(guò)測(cè)定甜瓜的生理生化指標(biāo)，如葉綠素含量、硝酸還原酶、抗壞血酸過(guò)氧化物酶、電解質(zhì)滲漏率、根系活力、SOD、CAT、APX活性等，對(duì)4個(gè)甜瓜品種進(jìn)行了耐寒性強(qiáng)弱排序。

形態(tài)指標(biāo)或者生理生化指標(biāo)雖然可以對(duì)相關(guān)植物進(jìn)行較為準(zhǔn)確的鑒定和評(píng)價(jià)，但僅從某一方面去衡量還是存在一定缺陷。本試驗(yàn)采用冷害指數(shù)指標(biāo)評(píng)價(jià)方法、形態(tài)學(xué)指標(biāo)聚類分析評(píng)價(jià)方法、生理生化指標(biāo)聚類分析評(píng)價(jià)方法，三者綜合分析不同材料之間的耐冷關(guān)系，進(jìn)行耐低溫材料的篩選，比單一的指標(biāo)更加準(zhǔn)確。通過(guò)冷害指數(shù)分級(jí)鑒定得到冷敏感型冬瓜材料有11份、弱耐冷型材料有6份、強(qiáng)耐冷型材料有6份；通過(guò)形態(tài)學(xué)指標(biāo)聚類得到冷敏感型冬瓜材料有2份、弱耐冷型材料有4份、強(qiáng)耐冷型材料有17份；通過(guò)生理生化指標(biāo)聚類得到冷敏感型冬瓜材料有9份、弱耐冷型材料有8份、強(qiáng)耐冷型材料有6份。三者綜合比較，最終篩選到冷敏感材料5，強(qiáng)耐冷型材料15和19。

雖然通過(guò)三者綜合評(píng)價(jià)篩選到耐低溫材料和冷敏桿型低溫材料，但從研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種單一的評(píng)價(jià)方式，其各個(gè)冬瓜材料耐低溫性結(jié)果不一致。造成這樣的原因可能是：冷害指數(shù)和形態(tài)學(xué)指標(biāo)的測(cè)定采用人工觀察進(jìn)行判斷，存在較大的誤差；生理生化指標(biāo)的測(cè)定過(guò)程中，試劑純度、溫度等對(duì)各種酶活性的影響；形態(tài)學(xué)指標(biāo)和生理生化指標(biāo)性狀在生長(zhǎng)過(guò)程中受到環(huán)境影響。所以通過(guò)有限的形態(tài)學(xué)指標(biāo)、生理生化指標(biāo)聚類劃分得到的結(jié)果出現(xiàn)了差異。因此，在以后的篩選耐低溫冬瓜材料過(guò)程中，需用進(jìn)行比本試驗(yàn)更多的指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，才能更加準(zhǔn)確的篩選出所需耐低溫材料。

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