許叔鵬 聶紅毅 羅婷 張明蓮 蘇松坤
(福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院,福州 350002)
蜜蜂白堊病是一種常見(jiàn)的蜜蜂幼蟲(chóng)病,該病屬于真菌性病害,由蜜蜂球囊菌感染幼蟲(chóng)引起。蜜蜂白堊病主要感染西方蜜蜂,蜂群染病會(huì)導(dǎo)致幼蟲(chóng)死亡,造成群勢(shì)下降,影響蜂群的采集能力,造成減產(chǎn)[1,2]。西方蜜蜂是我國(guó)飼養(yǎng)的主要蜂種,國(guó)內(nèi)絕大多數(shù)蜂產(chǎn)品都產(chǎn)自西方蜜蜂,所以白堊病對(duì)我國(guó)養(yǎng)蜂業(yè)而言是主要病害之一,作為第一個(gè)被全基因組測(cè)序的真菌性昆蟲(chóng)病原微生物,也可見(jiàn)蜜蜂白堊病相當(dāng)受到重視[3]。
蜜蜂的衛(wèi)生行為被普遍認(rèn)為與抗病相關(guān),具有衛(wèi)生行為的蜂群有更強(qiáng)的抗病性,能縮短蜜蜂球囊菌在蜂群中存在的時(shí)間,減少傳播機(jī)會(huì),從而控制白堊病。一般通過(guò)選育具有衛(wèi)生行為蜂群的蜂王來(lái)預(yù)防白堊病,但是對(duì)已產(chǎn)生孢子的蟲(chóng)尸的清理反而會(huì)加快病原在蜂群的傳播[4],所以選育幼蟲(chóng)本身具有抗白堊病能力的蜂種會(huì)更有效地降低白堊病的危害。分子生物學(xué)的高速發(fā)展促使從分子水平研究蜜蜂的病害,包括通過(guò)篩選分子遺傳標(biāo)記來(lái)選育抗白堊病蜂種而降低白堊病的危害。Holloway等采用QTL技術(shù)對(duì)比經(jīng)過(guò)病原接種篩選的易感病和抗病幼蟲(chóng)個(gè)體基因組區(qū)域,鑒定出蜜蜂幼蟲(chóng)11號(hào)染色體一個(gè)區(qū)域與蜜蜂幼蟲(chóng)抗白堊病性狀顯著相關(guān)[5,6],這給分子輔助選育提供了基礎(chǔ)。晏勵(lì)民等基于這項(xiàng)研究利用重測(cè)序技術(shù)篩選出位于編碼區(qū)的與蜜蜂抗白堊病相關(guān)的SNP位點(diǎn)680個(gè),有118個(gè)位于第11條染色體,52個(gè)位于第2條染色體[7]。劉元珍等基于該研究發(fā)現(xiàn)位于MRJP5上的C2587245T位點(diǎn)與蜜蜂幼蟲(chóng)抗白堊病性狀顯著相關(guān),該位點(diǎn)為C/T多態(tài)性位點(diǎn),堿基C的基因頻率越高蜂群抗白堊病能力越強(qiáng),利用這一發(fā)現(xiàn)可以方便的鑒別蜂群的抗白堊病能力[8]。
高分辨率熔解曲線(High Resolution Melting,HRM)是近年來(lái)興起的一種單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法,具有高靈敏度、高特異性、高通量、操作簡(jiǎn)便快捷、成本低等優(yōu)點(diǎn)[9-11]。該方法通過(guò)在DNA雙鏈中嵌入飽和熒光染料,在一定溫度范圍內(nèi)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行程序升溫使其加熱變性,實(shí)時(shí)采集、分析熒光信號(hào)并繪制DNA熔解曲線,最終根據(jù)熔解曲線及熔解溫度的不同來(lái)區(qū)分突變類型[12,13]。
本研究以福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院飼養(yǎng)的“蜂強(qiáng)1號(hào)”意蜂實(shí)驗(yàn)蜂群作為研究材料,從蜂群中收集50只蜜蜂進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
采用酚氯仿法提取蜜蜂樣本的DNA,將50只蜜蜂的胸部剪下,分別放入1.5 ml離心管中,加入由1 mol/l Tris-HCl(pH=8.0)、0.5 mol/l EDTA、SDS配成的DNA抽提緩沖液進(jìn)行研磨混勻形成勻漿,另外加入蛋白酶K后55℃水浴過(guò)夜。之后使用平衡酚、酚氯仿及氯仿各抽提一次去除雜質(zhì),并用無(wú)水乙醇沉淀DNA,然后用70%乙醇洗滌DNA沉淀,最后用無(wú)菌水溶解DNA沉淀。將溶解后的DNA用NanoDrop 2000型超微量分光光度計(jì)測(cè)得其質(zhì)量與濃度,并用無(wú)菌水稀釋至10 ng/μl。
根據(jù)SNP位點(diǎn)的信息,在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心上查出目標(biāo)位點(diǎn)前后各500 bp的DNA片段,然后根據(jù)基因片段用Primer 6.0設(shè)計(jì)引物,使通過(guò)引物擴(kuò)增出來(lái)的產(chǎn)物包含目的SNP位點(diǎn),且目的DNA片段的大小為100~200 bp,引物由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行合成。
利用EasyTaq PCR SuperMix(Transgen Biotech)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,根據(jù)說(shuō)明書(shū)配置PCR反應(yīng)體系,反應(yīng)總體積為20 μl。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 2 min;94℃ 30s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為149 bp。為了篩選確定基因型的樣本進(jìn)行HRM檢測(cè),將PCR產(chǎn)物通過(guò)測(cè)序來(lái)驗(yàn)證基因型,測(cè)序由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司來(lái)完成。
表1 HRM法檢測(cè)基因多態(tài)性位點(diǎn)C2587245T的引物序列
利用Precision Melt Supermix(BIO-RAD)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為20 μl,包括10 μl Precision melt supermix,200 nM引物以及40 ng DNA模板,DNA模板為經(jīng)過(guò)測(cè)序篩選出來(lái)的C/T型模板3個(gè),T/T型模板3個(gè)及C/T型模板3個(gè),每個(gè)模板設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。使用的儀器為Bio-Rad的CFX96熒光定量PCR系統(tǒng)。
PCR擴(kuò)增程序:95℃ 2 min;95℃ 10 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);72℃ 30 s。
HRM分析程序:95℃ 30 s,60℃ 1 min,以0.02℃/s的速度從65℃上升到95℃,分析熔解曲線。
經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增及測(cè)序,50個(gè)樣本在C2587245T位點(diǎn)有3種基因型,其結(jié)果如圖1所示,自上而下依次是C/T型、T/T型及C/C型的測(cè)序峰圖。
圖1 C2587245T位點(diǎn)的3種測(cè)序峰圖
選取不同基因型的樣本各3個(gè),驗(yàn)證是否能夠通過(guò)HRM方法精確分辨這3種基因型,結(jié)果如圖2所示,左邊的熔解曲線圖可以看出隨著溫度升高,DNA雙鏈解鏈,熒光信號(hào)隨之下降,不同基因型模板的產(chǎn)物熔解曲線存在一定差異,C/C型模板的PCR產(chǎn)物最易解鏈?zhǔn)篃晒馊玖厦撀?,造成信?hào)減弱最快,其次是C/T雜合型,再次是TT純合型;右邊的熔解溫度圖也能看到3型模板的PCR產(chǎn)物熔解溫度也存在明顯差異,C/C純合型的熔解溫度最低,C/T雜合型的熔解溫度介于C/C純合與T/T純合之間,T/T純合型則具有最高的熔解溫度。所以通過(guò)HRM法能夠辨別不同基因型樣本之間因單個(gè)堿基不同產(chǎn)生的熔解曲線差異,進(jìn)而區(qū)分不同基因型樣本。
圖2 3種基因型樣本的熔解曲線及熔解溫度
SNP分子標(biāo)記因其具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、密度高、分布廣、檢測(cè)快速、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于疾病研究及動(dòng)植物抗病育種等領(lǐng)域。劉元珍等發(fā)現(xiàn)了C2587245T多態(tài)性位點(diǎn)與蜜蜂幼蟲(chóng)抗白堊病性狀顯著相關(guān),通過(guò)檢測(cè)蜂群在該位點(diǎn)的基因型,能夠鑒別蜂群的抗白堊病能力[8]。傳統(tǒng)的SNP基因分型方法主要有PCR產(chǎn)物測(cè)序法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)法、Taqman探針?lè)ǖ取CR產(chǎn)物測(cè)序法包括PCR步驟及送公司測(cè)序,一方面需要的時(shí)間較長(zhǎng),另外花費(fèi)也較高;RFLP法則是利用酶切的手段,將具有多態(tài)性的DNA片段用合適的限制性核酸內(nèi)切酶酶切出具有長(zhǎng)度差異的片段,這種差異是由限制性酶切位點(diǎn)上堿基的多態(tài)性引起的,根據(jù)酶切片段的差異能夠?qū)NP進(jìn)行基因分型,但是一方面該方法對(duì)于序列要求較高,需要在SNP處存在酶切位點(diǎn),另一方面在PCR和酶切后還要通過(guò)電泳觀察條帶來(lái)鑒別基因型,整體實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜,耗時(shí)長(zhǎng),不適用于大規(guī)模的SNP基因分型[14];Taqman探針?lè)▌t是需要針對(duì)不同SNP位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)PCR引物和探針,花費(fèi)較高且不適合大量的SNP位點(diǎn)分析。不同SNP標(biāo)記基因分型方法的操作難度、花銷及時(shí)耗都有差異,合適、易行、省時(shí)的分型方法在遺傳育種的實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域具有相當(dāng)重要的意義。
HRM法的原理是在普通PCR的基礎(chǔ)上,通過(guò)使用飽和熒光染料結(jié)合DNA雙鏈,在PCR擴(kuò)增完成后通過(guò)程序升溫使產(chǎn)物逐漸解鏈,造成熒光物質(zhì)脫落,熒光信號(hào)減弱,HRM程序能夠根據(jù)實(shí)時(shí)的檢測(cè)繪制出熒光信號(hào)隨溫度升高逐漸減弱的熔解曲線圖。由于堿基的差異,雙鏈解鏈的溫度也存在細(xì)小的差異,精密的程序升溫與熒光信號(hào)收集能捕捉到這細(xì)小的差異從而進(jìn)行基因分型[13]。HRM法較傳統(tǒng)的PCR產(chǎn)物測(cè)序法、RFLP法與Taqman探針?lè)?,具有成本低、操作?jiǎn)單、快捷的優(yōu)點(diǎn),用HRM來(lái)基因分型無(wú)需測(cè)序,無(wú)需酶切、電泳,也不需要進(jìn)行探針的設(shè)計(jì),只要在PCR擴(kuò)增完成后追加一步程序升溫及熒光檢測(cè)即可,而現(xiàn)在大多數(shù)市售的熒光定量PCR儀都帶有HRM程序,可以直接進(jìn)行HRM分型實(shí)驗(yàn)。所以本研究通過(guò)HRM法嘗試對(duì)意大利蜜蜂幼蟲(chóng)與抗白堊病相關(guān)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)C2587245T進(jìn)行基因分型,以期建立一種快捷的分型方法。
在本實(shí)驗(yàn)中共測(cè)序檢測(cè)了50個(gè)樣本,選取C/T型、T/T型、C/C型樣本各3例來(lái)嘗試進(jìn)行HRM基因分型。驗(yàn)證結(jié)果和測(cè)序結(jié)果相符,存在3種基因型。將熔解曲線與測(cè)序結(jié)果匹配起來(lái),得到了3種基因型所對(duì)應(yīng)的熔解曲線及熔解溫度,該數(shù)據(jù)可以為以后進(jìn)行關(guān)于多態(tài)性位點(diǎn)C2587245T高通量的基因分型提供參考。通過(guò)該實(shí)驗(yàn),HRM法進(jìn)行基因分型的低成本、易操作的特性也得到了充分體現(xiàn),希望該研究能夠?yàn)镠RM法直接檢測(cè)SNP位點(diǎn)提供參考。
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