許叔鵬 聶紅毅 羅婷 張明蓮 蘇松坤

（福建農(nóng)林大學蜂學學院，福州 350002）

蜜蜂白堊病是一種常見的蜜蜂幼蟲病，該病屬于真菌性病害，由蜜蜂球囊菌感染幼蟲引起。蜜蜂白堊病主要感染西方蜜蜂，蜂群染病會導致幼蟲死亡，造成群勢下降，影響蜂群的采集能力，造成減產(chǎn)[1,2]。西方蜜蜂是我國飼養(yǎng)的主要蜂種，國內(nèi)絕大多數(shù)蜂產(chǎn)品都產(chǎn)自西方蜜蜂，所以白堊病對我國養(yǎng)蜂業(yè)而言是主要病害之一，作為第一個被全基因組測序的真菌性昆蟲病原微生物，也可見蜜蜂白堊病相當受到重視[3]。

蜜蜂的衛(wèi)生行為被普遍認為與抗病相關(guān)，具有衛(wèi)生行為的蜂群有更強的抗病性，能縮短蜜蜂球囊菌在蜂群中存在的時間，減少傳播機會，從而控制白堊病。一般通過選育具有衛(wèi)生行為蜂群的蜂王來預(yù)防白堊病，但是對已產(chǎn)生孢子的蟲尸的清理反而會加快病原在蜂群的傳播[4]，所以選育幼蟲本身具有抗白堊病能力的蜂種會更有效地降低白堊病的危害。分子生物學的高速發(fā)展促使從分子水平研究蜜蜂的病害，包括通過篩選分子遺傳標記來選育抗白堊病蜂種而降低白堊病的危害。Holloway等采用QTL技術(shù)對比經(jīng)過病原接種篩選的易感病和抗病幼蟲個體基因組區(qū)域，鑒定出蜜蜂幼蟲11號染色體一個區(qū)域與蜜蜂幼蟲抗白堊病性狀顯著相關(guān)[5,6]，這給分子輔助選育提供了基礎(chǔ)。晏勵民等基于這項研究利用重測序技術(shù)篩選出位于編碼區(qū)的與蜜蜂抗白堊病相關(guān)的SNP位點680個，有118個位于第11條染色體，52個位于第2條染色體[7]。劉元珍等基于該研究發(fā)現(xiàn)位于MRJP5上的C2587245T位點與蜜蜂幼蟲抗白堊病性狀顯著相關(guān)，該位點為C/T多態(tài)性位點，堿基C的基因頻率越高蜂群抗白堊病能力越強，利用這一發(fā)現(xiàn)可以方便的鑒別蜂群的抗白堊病能力[8]。

高分辨率熔解曲線（High Resolution Melting，HRM）是近年來興起的一種單核苷酸多態(tài)性檢測方法，具有高靈敏度、高特異性、高通量、操作簡便快捷、成本低等優(yōu)點[9-11]。該方法通過在DNA雙鏈中嵌入飽和熒光染料，在一定溫度范圍內(nèi)對PCR產(chǎn)物進行程序升溫使其加熱變性，實時采集、分析熒光信號并繪制DNA熔解曲線，最終根據(jù)熔解曲線及熔解溫度的不同來區(qū)分突變類型[12,13]。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以福建農(nóng)林大學蜂學學院飼養(yǎng)的“蜂強1號”意蜂實驗蜂群作為研究材料，從蜂群中收集50只蜜蜂進行實驗。

1.2 DNA的提取

采用酚氯仿法提取蜜蜂樣本的DNA，將50只蜜蜂的胸部剪下，分別放入1.5 ml離心管中，加入由1 mol/l Tris-HCl（pH=8.0）、0.5 mol/l EDTA、SDS配成的DNA抽提緩沖液進行研磨混勻形成勻漿，另外加入蛋白酶K后55℃水浴過夜。之后使用平衡酚、酚氯仿及氯仿各抽提一次去除雜質(zhì)，并用無水乙醇沉淀DNA，然后用70%乙醇洗滌DNA沉淀，最后用無菌水溶解DNA沉淀。將溶解后的DNA用NanoDrop 2000型超微量分光光度計測得其質(zhì)量與濃度，并用無菌水稀釋至10 ng/μl。

1.3 引物合成

根據(jù)SNP位點的信息，在美國國立生物技術(shù)信息中心上查出目標位點前后各500 bp的DNA片段，然后根據(jù)基因片段用Primer 6.0設(shè)計引物，使通過引物擴增出來的產(chǎn)物包含目的SNP位點，且目的DNA片段的大小為100～200 bp，引物由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進行合成。

1.4 PCR擴增及測序

利用EasyTaq PCR SuperMix（Transgen Biotech）進行PCR擴增，根據(jù)說明書配置PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)總體積為20 μl。PCR擴增程序為94℃ 2 min；94℃ 30s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 5 min。擴增產(chǎn)物長度為149 bp。為了篩選確定基因型的樣本進行HRM檢測，將PCR產(chǎn)物通過測序來驗證基因型，測序由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司來完成。

表1 HRM法檢測基因多態(tài)性位點C2587245T的引物序列

1.5 擴增與HRM分析

利用Precision Melt Supermix（BIO-RAD）進行PCR擴增，反應(yīng)體系為20 μl，包括10 μl Precision melt supermix，200 nM引物以及40 ng DNA模板，DNA模板為經(jīng)過測序篩選出來的C/T型模板3個，T/T型模板3個及C/T型模板3個，每個模板設(shè)置3個復孔。使用的儀器為Bio-Rad的CFX96熒光定量PCR系統(tǒng)。

PCR擴增程序：95℃ 2 min；95℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)；72℃ 30 s。

HRM分析程序：95℃ 30 s，60℃ 1 min，以0.02℃/s的速度從65℃上升到95℃，分析熔解曲線。

2 結(jié)果

2.1 測序結(jié)果

經(jīng)過PCR擴增及測序，50個樣本在C2587245T位點有3種基因型，其結(jié)果如圖1所示，自上而下依次是C/T型、T/T型及C/C型的測序峰圖。

圖1 C2587245T位點的3種測序峰圖

2.2 HRM分析結(jié)果

選取不同基因型的樣本各3個，驗證是否能夠通過HRM方法精確分辨這3種基因型，結(jié)果如圖2所示，左邊的熔解曲線圖可以看出隨著溫度升高，DNA雙鏈解鏈，熒光信號隨之下降，不同基因型模板的產(chǎn)物熔解曲線存在一定差異，C/C型模板的PCR產(chǎn)物最易解鏈使熒光染料脫落，造成信號減弱最快，其次是C/T雜合型，再次是TT純合型；右邊的熔解溫度圖也能看到3型模板的PCR產(chǎn)物熔解溫度也存在明顯差異，C/C純合型的熔解溫度最低，C/T雜合型的熔解溫度介于C/C純合與T/T純合之間，T/T純合型則具有最高的熔解溫度。所以通過HRM法能夠辨別不同基因型樣本之間因單個堿基不同產(chǎn)生的熔解曲線差異，進而區(qū)分不同基因型樣本。

3 討論

圖2 3種基因型樣本的熔解曲線及熔解溫度

SNP分子標記因其具有結(jié)構(gòu)簡單、密度高、分布廣、檢測快速、易實現(xiàn)自動化檢測等特點，被廣泛應(yīng)用于疾病研究及動植物抗病育種等領(lǐng)域。劉元珍等發(fā)現(xiàn)了C2587245T多態(tài)性位點與蜜蜂幼蟲抗白堊病性狀顯著相關(guān)，通過檢測蜂群在該位點的基因型，能夠鑒別蜂群的抗白堊病能力[8]。傳統(tǒng)的SNP基因分型方法主要有PCR產(chǎn)物測序法、限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）法、Taqman探針法等。PCR產(chǎn)物測序法包括PCR步驟及送公司測序，一方面需要的時間較長，另外花費也較高；RFLP法則是利用酶切的手段，將具有多態(tài)性的DNA片段用合適的限制性核酸內(nèi)切酶酶切出具有長度差異的片段，這種差異是由限制性酶切位點上堿基的多態(tài)性引起的，根據(jù)酶切片段的差異能夠?qū)NP進行基因分型，但是一方面該方法對于序列要求較高，需要在SNP處存在酶切位點，另一方面在PCR和酶切后還要通過電泳觀察條帶來鑒別基因型，整體實驗操作復雜，耗時長，不適用于大規(guī)模的SNP基因分型[14]；Taqman探針法則是需要針對不同SNP位點分別設(shè)計PCR引物和探針，花費較高且不適合大量的SNP位點分析。不同SNP標記基因分型方法的操作難度、花銷及時耗都有差異，合適、易行、省時的分型方法在遺傳育種的實際應(yīng)用領(lǐng)域具有相當重要的意義。

HRM法的原理是在普通PCR的基礎(chǔ)上，通過使用飽和熒光染料結(jié)合DNA雙鏈，在PCR擴增完成后通過程序升溫使產(chǎn)物逐漸解鏈，造成熒光物質(zhì)脫落，熒光信號減弱，HRM程序能夠根據(jù)實時的檢測繪制出熒光信號隨溫度升高逐漸減弱的熔解曲線圖。由于堿基的差異，雙鏈解鏈的溫度也存在細小的差異，精密的程序升溫與熒光信號收集能捕捉到這細小的差異從而進行基因分型[13]。HRM法較傳統(tǒng)的PCR產(chǎn)物測序法、RFLP法與Taqman探針法，具有成本低、操作簡單、快捷的優(yōu)點，用HRM來基因分型無需測序，無需酶切、電泳，也不需要進行探針的設(shè)計，只要在PCR擴增完成后追加一步程序升溫及熒光檢測即可，而現(xiàn)在大多數(shù)市售的熒光定量PCR儀都帶有HRM程序，可以直接進行HRM分型實驗。所以本研究通過HRM法嘗試對意大利蜜蜂幼蟲與抗白堊病相關(guān)單核苷酸多態(tài)性位點C2587245T進行基因分型，以期建立一種快捷的分型方法。

在本實驗中共測序檢測了50個樣本，選取C/T型、T/T型、C/C型樣本各3例來嘗試進行HRM基因分型。驗證結(jié)果和測序結(jié)果相符，存在3種基因型。將熔解曲線與測序結(jié)果匹配起來，得到了3種基因型所對應(yīng)的熔解曲線及熔解溫度，該數(shù)據(jù)可以為以后進行關(guān)于多態(tài)性位點C2587245T高通量的基因分型提供參考。通過該實驗，HRM法進行基因分型的低成本、易操作的特性也得到了充分體現(xiàn)，希望該研究能夠為HRM法直接檢測SNP位點提供參考。

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