許叔鵬 聶紅毅 羅婷 張明蓮 蘇松坤

（福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州 350002）

蜜蜂白堊病是一種常見(jiàn)的蜜蜂幼蟲(chóng)病，該病屬于真菌性病害，由蜜蜂球囊菌感染幼蟲(chóng)引起。蜜蜂白堊病主要感染西方蜜蜂，蜂群染病會(huì)導(dǎo)致幼蟲(chóng)死亡，造成群勢(shì)下降，影響蜂群的采集能力，造成減產(chǎn)[1,2]。西方蜜蜂是我國(guó)飼養(yǎng)的主要蜂種，國(guó)內(nèi)絕大多數(shù)蜂產(chǎn)品都產(chǎn)自西方蜜蜂，所以白堊病對(duì)我國(guó)養(yǎng)蜂業(yè)而言是主要病害之一，作為第一個(gè)被全基因組測(cè)序的真菌性昆蟲(chóng)病原微生物，也可見(jiàn)蜜蜂白堊病相當(dāng)受到重視[3]。

蜜蜂的衛(wèi)生行為被普遍認(rèn)為與抗病相關(guān)，具有衛(wèi)生行為的蜂群有更強(qiáng)的抗病性，能縮短蜜蜂球囊菌在蜂群中存在的時(shí)間，減少傳播機(jī)會(huì)，從而控制白堊病。一般通過(guò)選育具有衛(wèi)生行為蜂群的蜂王來(lái)預(yù)防白堊病，但是對(duì)已產(chǎn)生孢子的蟲(chóng)尸的清理反而會(huì)加快病原在蜂群的傳播[4]，所以選育幼蟲(chóng)本身具有抗白堊病能力的蜂種會(huì)更有效地降低白堊病的危害。分子生物學(xué)的高速發(fā)展促使從分子水平研究蜜蜂的病害，包括通過(guò)篩選分子遺傳標(biāo)記來(lái)選育抗白堊病蜂種而降低白堊病的危害。Holloway等采用QTL技術(shù)對(duì)比經(jīng)過(guò)病原接種篩選的易感病和抗病幼蟲(chóng)個(gè)體基因組區(qū)域，鑒定出蜜蜂幼蟲(chóng)11號(hào)染色體一個(gè)區(qū)域與蜜蜂幼蟲(chóng)抗白堊病性狀顯著相關(guān)[5,6]，這給分子輔助選育提供了基礎(chǔ)。晏勵(lì)民等基于這項(xiàng)研究利用重測(cè)序技術(shù)篩選出位于編碼區(qū)的與蜜蜂抗白堊病相關(guān)的SNP位點(diǎn)680個(gè)，有118個(gè)位于第11條染色體，52個(gè)位于第2條染色體[7]。劉元珍等基于該研究發(fā)現(xiàn)位于MRJP5上的C2587245T位點(diǎn)與蜜蜂幼蟲(chóng)抗白堊病性狀顯著相關(guān)，該位點(diǎn)為C/T多態(tài)性位點(diǎn)，堿基C的基因頻率越高蜂群抗白堊病能力越強(qiáng)，利用這一發(fā)現(xiàn)可以方便的鑒別蜂群的抗白堊病能力[8]。

高分辨率熔解曲線（High Resolution Melting，HRM）是近年來(lái)興起的一種單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法，具有高靈敏度、高特異性、高通量、操作簡(jiǎn)便快捷、成本低等優(yōu)點(diǎn)[9-11]。該方法通過(guò)在DNA雙鏈中嵌入飽和熒光染料，在一定溫度范圍內(nèi)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行程序升溫使其加熱變性，實(shí)時(shí)采集、分析熒光信號(hào)并繪制DNA熔解曲線，最終根據(jù)熔解曲線及熔解溫度的不同來(lái)區(qū)分突變類型[12,13]。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院飼養(yǎng)的“蜂強(qiáng)1號(hào)”意蜂實(shí)驗(yàn)蜂群作為研究材料，從蜂群中收集50只蜜蜂進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 DNA的提取

采用酚氯仿法提取蜜蜂樣本的DNA，將50只蜜蜂的胸部剪下，分別放入1.5 ml離心管中，加入由1 mol/l Tris-HCl（pH=8.0）、0.5 mol/l EDTA、SDS配成的DNA抽提緩沖液進(jìn)行研磨混勻形成勻漿，另外加入蛋白酶K后55℃水浴過(guò)夜。之后使用平衡酚、酚氯仿及氯仿各抽提一次去除雜質(zhì)，并用無(wú)水乙醇沉淀DNA，然后用70%乙醇洗滌DNA沉淀，最后用無(wú)菌水溶解DNA沉淀。將溶解后的DNA用NanoDrop 2000型超微量分光光度計(jì)測(cè)得其質(zhì)量與濃度，并用無(wú)菌水稀釋至10 ng/μl。

1.3 引物合成

根據(jù)SNP位點(diǎn)的信息，在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心上查出目標(biāo)位點(diǎn)前后各500 bp的DNA片段，然后根據(jù)基因片段用Primer 6.0設(shè)計(jì)引物，使通過(guò)引物擴(kuò)增出來(lái)的產(chǎn)物包含目的SNP位點(diǎn)，且目的DNA片段的大小為100～200 bp，引物由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行合成。

1.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

利用EasyTaq PCR SuperMix（Transgen Biotech）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)說(shuō)明書(shū)配置PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)總體積為20 μl。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 2 min；94℃ 30s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為149 bp。為了篩選確定基因型的樣本進(jìn)行HRM檢測(cè)，將PCR產(chǎn)物通過(guò)測(cè)序來(lái)驗(yàn)證基因型，測(cè)序由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司來(lái)完成。

表1 HRM法檢測(cè)基因多態(tài)性位點(diǎn)C2587245T的引物序列

1.5 擴(kuò)增與HRM分析

利用Precision Melt Supermix（BIO-RAD）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μl，包括10 μl Precision melt supermix，200 nM引物以及40 ng DNA模板，DNA模板為經(jīng)過(guò)測(cè)序篩選出來(lái)的C/T型模板3個(gè)，T/T型模板3個(gè)及C/T型模板3個(gè)，每個(gè)模板設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。使用的儀器為Bio-Rad的CFX96熒光定量PCR系統(tǒng)。

PCR擴(kuò)增程序：95℃ 2 min；95℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 30 s。

HRM分析程序：95℃ 30 s，60℃ 1 min，以0.02℃/s的速度從65℃上升到95℃，分析熔解曲線。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序結(jié)果

經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增及測(cè)序，50個(gè)樣本在C2587245T位點(diǎn)有3種基因型，其結(jié)果如圖1所示，自上而下依次是C/T型、T/T型及C/C型的測(cè)序峰圖。

圖1 C2587245T位點(diǎn)的3種測(cè)序峰圖

2.2 HRM分析結(jié)果

選取不同基因型的樣本各3個(gè)，驗(yàn)證是否能夠通過(guò)HRM方法精確分辨這3種基因型，結(jié)果如圖2所示，左邊的熔解曲線圖可以看出隨著溫度升高，DNA雙鏈解鏈，熒光信號(hào)隨之下降，不同基因型模板的產(chǎn)物熔解曲線存在一定差異，C/C型模板的PCR產(chǎn)物最易解鏈?zhǔn)篃晒馊玖厦撀?，造成信?hào)減弱最快，其次是C/T雜合型，再次是TT純合型；右邊的熔解溫度圖也能看到3型模板的PCR產(chǎn)物熔解溫度也存在明顯差異，C/C純合型的熔解溫度最低，C/T雜合型的熔解溫度介于C/C純合與T/T純合之間，T/T純合型則具有最高的熔解溫度。所以通過(guò)HRM法能夠辨別不同基因型樣本之間因單個(gè)堿基不同產(chǎn)生的熔解曲線差異，進(jìn)而區(qū)分不同基因型樣本。

3 討論

圖2 3種基因型樣本的熔解曲線及熔解溫度

SNP分子標(biāo)記因其具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、密度高、分布廣、檢測(cè)快速、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于疾病研究及動(dòng)植物抗病育種等領(lǐng)域。劉元珍等發(fā)現(xiàn)了C2587245T多態(tài)性位點(diǎn)與蜜蜂幼蟲(chóng)抗白堊病性狀顯著相關(guān)，通過(guò)檢測(cè)蜂群在該位點(diǎn)的基因型，能夠鑒別蜂群的抗白堊病能力[8]。傳統(tǒng)的SNP基因分型方法主要有PCR產(chǎn)物測(cè)序法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）法、Taqman探針?lè)ǖ取CR產(chǎn)物測(cè)序法包括PCR步驟及送公司測(cè)序，一方面需要的時(shí)間較長(zhǎng)，另外花費(fèi)也較高；RFLP法則是利用酶切的手段，將具有多態(tài)性的DNA片段用合適的限制性核酸內(nèi)切酶酶切出具有長(zhǎng)度差異的片段，這種差異是由限制性酶切位點(diǎn)上堿基的多態(tài)性引起的，根據(jù)酶切片段的差異能夠?qū)NP進(jìn)行基因分型，但是一方面該方法對(duì)于序列要求較高，需要在SNP處存在酶切位點(diǎn)，另一方面在PCR和酶切后還要通過(guò)電泳觀察條帶來(lái)鑒別基因型，整體實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，不適用于大規(guī)模的SNP基因分型[14]；Taqman探針?lè)▌t是需要針對(duì)不同SNP位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)PCR引物和探針，花費(fèi)較高且不適合大量的SNP位點(diǎn)分析。不同SNP標(biāo)記基因分型方法的操作難度、花銷及時(shí)耗都有差異，合適、易行、省時(shí)的分型方法在遺傳育種的實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域具有相當(dāng)重要的意義。

HRM法的原理是在普通PCR的基礎(chǔ)上，通過(guò)使用飽和熒光染料結(jié)合DNA雙鏈，在PCR擴(kuò)增完成后通過(guò)程序升溫使產(chǎn)物逐漸解鏈，造成熒光物質(zhì)脫落，熒光信號(hào)減弱，HRM程序能夠根據(jù)實(shí)時(shí)的檢測(cè)繪制出熒光信號(hào)隨溫度升高逐漸減弱的熔解曲線圖。由于堿基的差異，雙鏈解鏈的溫度也存在細(xì)小的差異，精密的程序升溫與熒光信號(hào)收集能捕捉到這細(xì)小的差異從而進(jìn)行基因分型[13]。HRM法較傳統(tǒng)的PCR產(chǎn)物測(cè)序法、RFLP法與Taqman探針?lè)?，具有成本低、操作?jiǎn)單、快捷的優(yōu)點(diǎn)，用HRM來(lái)基因分型無(wú)需測(cè)序，無(wú)需酶切、電泳，也不需要進(jìn)行探針的設(shè)計(jì)，只要在PCR擴(kuò)增完成后追加一步程序升溫及熒光檢測(cè)即可，而現(xiàn)在大多數(shù)市售的熒光定量PCR儀都帶有HRM程序，可以直接進(jìn)行HRM分型實(shí)驗(yàn)。所以本研究通過(guò)HRM法嘗試對(duì)意大利蜜蜂幼蟲(chóng)與抗白堊病相關(guān)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)C2587245T進(jìn)行基因分型，以期建立一種快捷的分型方法。

在本實(shí)驗(yàn)中共測(cè)序檢測(cè)了50個(gè)樣本，選取C/T型、T/T型、C/C型樣本各3例來(lái)嘗試進(jìn)行HRM基因分型。驗(yàn)證結(jié)果和測(cè)序結(jié)果相符，存在3種基因型。將熔解曲線與測(cè)序結(jié)果匹配起來(lái)，得到了3種基因型所對(duì)應(yīng)的熔解曲線及熔解溫度，該數(shù)據(jù)可以為以后進(jìn)行關(guān)于多態(tài)性位點(diǎn)C2587245T高通量的基因分型提供參考。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)，HRM法進(jìn)行基因分型的低成本、易操作的特性也得到了充分體現(xiàn)，希望該研究能夠?yàn)镠RM法直接檢測(cè)SNP位點(diǎn)提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1]Bailey L.Infectious diseases of the honey-bee [J].London： Land Books Ltd., 1963： 176.

[2]Zaghloul O A, Mourad A K, El Kady M B, et al.Assessment of losses in honey yield due to the chalkbrood disease, with reference to the determination of its economic injury levels in Egypt [J].Communications in Agricultural and Applied Biological Sciences, 2005, 70(4)： 703-714.

[3]Qin X, Evans J D, Aronstein K A, et al.Genome sequences of the honey bee pathogensPaenibacillus larvaeandAscosphaera apis[J].Insect Mol Biol, 2006, 15(5)： 715-718.

[4]Invernizzi C, Rivas F, Bettucci L.Resistance to Chalkbrood disease inApis melliferaL.(Hymenoptera： Apidae) colonies with different hygienic behaviour [J].Neotrop Entomol, 2011, 40(1)： 28-34.

[5]Holloway B, Tarver M R, Rinderer T E.Fine mapping identifies significantly associating markers for resistance to the honey bee brood fungal disease, Chalkbrood [J].Journal of Apicultural Research, 2013,52(3)： 134-140.

[6]Holloway B, Sylvester H A, Bourgeois L, et al.Association of single nucleotide polymorphisms to resistance to chalkbrood inApis mellifera[J].Journal of Apicultural Research, 2012, 51(2)： 154-163.

[7]晏勵(lì)民.基于SNP重測(cè)序技術(shù)的蜜蜂抗白堊病性狀相關(guān)的分子標(biāo)記篩選[D].浙江大學(xué)，2014.

[8]Liu Y, Yan L, Li Z, et al.Larva-mediated chalkbrood resistanceassociated single nucleotide polymorphism markers in the honey beeApis mellifera[J].Insect Mol Biol, 2016, 25(3)： 239-250.

[9]張遠(yuǎn)，何霞，鐘磊，等.高分辨率熔解曲線法在GLP1R基因多態(tài)性位點(diǎn)rs3765467檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)藥房，2017, 28(17)： 2305-2308.

[10]應(yīng)斌武.高分辨熔解曲線分析在遺傳病分子診斷中的應(yīng)用[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2017, 40(2)： 146-148.

[11]王倩，閆雯，沈明輝，等.熒光染料SYTO13用于高分辨熔解曲線技術(shù)SNP基因分型的評(píng)價(jià)[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2017, 40(2)： 88-94.

[12]Nguyen-Dumont T, Calvez-Kelm F L, Forey N, et al.Description and validation of high-throughput simultaneous genotyping and mutation scanning by high-resolution melting curve analysis [J].Human Mutation,2009, 6(9)： 884-890.

[13]Chambliss A B, Resnick M, Petrides A K, et al.Rapid screening for targeted genetic variants via high-resolution melting curve analysis [J].Clinical Chemistry & Laboratory Medicine, 2016, 55(4)： 507-516.

[14]黨進(jìn)軍.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性[J].生命的化學(xué)，1985(6)：9-10.