耿海洋 張猛 聶紅毅 蘇松坤

（福建農(nóng)林大學 蜂學學院， 福州 350002）

近幾年基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速，特別是CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)，將基因組編輯技術(shù)帶到一個新高度。它具有設(shè)計簡單、特異性強、效率高等優(yōu)點，這讓很多普通實驗室都可以運用該技術(shù)[1]。目前該技術(shù)已經(jīng)成功地運用在很多模式生物中，如果蠅[2]、家蠶[3]及斑馬魚[4]等。蜜蜂是一種重要的經(jīng)濟昆蟲，其產(chǎn)品及其制品在保健行業(yè)和醫(yī)療領(lǐng)域起著越來越重要的作用。同時蜜蜂又是植物重要的傳粉者，其授粉價值和生態(tài)作用更是不可估量。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)平臺在蜜蜂領(lǐng)域中的建立，有助于揭開蜜蜂復雜社會行為與基因功能的關(guān)系，也有助于加快蜜蜂優(yōu)良性狀分子育種的進程，具有十分重要的現(xiàn)實意義。2016年，日本學者Hiroki Kohno等[5]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在意大利蜜蜂G0代中敲除了王漿組蛋白mrjp1，但是該研究并沒有在G1代中成功篩選出純合突變體，也沒有真正在蜜蜂領(lǐng)域中建立起CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)。因此，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在蜜蜂領(lǐng)域中的建立顯得極為迫切。

蜂卵的顯微注射技術(shù)是蜜蜂基因組編輯中最重要的技術(shù)之一，而將顯微注射后的蜂卵培育成蜂王是基因編輯技術(shù)在蜜蜂領(lǐng)域中應(yīng)用的不可缺少的重要環(huán)節(jié)，但是截至目前還沒有用顯微注射后的蜂卵培育蜂王的方法的相關(guān)報道。由于注射后的蜂卵體表還留有傷口，蜂群中的蜜蜂會將其當作異物直接清理掉，所以它不能像先前報道的移卵育王[6]直接將蜂卵轉(zhuǎn)移到育王杯中。將注射后的蜂卵培育成蜂王的難點主要有4個：其一是顯微注射對蜂卵的安放位置以及傾斜角度要求很高，當完成注射后，很難對蜂卵進行第二次轉(zhuǎn)移，也就不能像Jakob Wegener等[7]用改造的牙鉤將蜂卵轉(zhuǎn)移到涂有蜂蠟的尼龍繩上進行培養(yǎng)；其二是剛孵化的小幼蟲體色接近透明，體表有粘性很難用移蟲針進行轉(zhuǎn)移；其三是室內(nèi)培養(yǎng)至孵化的小幼蟲不像蜂群中孵化的小幼蟲能夠立刻得到內(nèi)勤蜂的照顧并有新鮮的蜂王漿可供享用；其四是在給實驗室內(nèi)的小幼蟲飼喂蜂王漿時也很容易將其淹死。因此如何將顯微注射后的蜂卵培育成蜂王是困擾很多研究者的難題。

目前蜂卵的顯微注射技術(shù)日漸成熟，早在1988年，Milne等人就已經(jīng)摸索出一套蜂卵注射方法，每小時可以注射蜂卵100粒，同時可以達到21%的蜂卵孵化率[8]。1998年，邵瑞宜在此基礎(chǔ)上將蜂卵的孵化率提高到35.13%[9]。2017年，本實驗室已經(jīng)能夠?qū)⒆⑸浜蠓渎训姆趸侍岣叩?0%（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。在蜂卵注射的基礎(chǔ)上，本試驗初步提供了幾種用顯微注射后的蜂卵培育蜂王的方法，并通過王臺接受率對這3種方法進行比較，期望能為CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在蜜蜂領(lǐng)域中的建立提供將注射后的蜂卵培育成蜂王的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

恒溫恒濕培養(yǎng)箱（STIK, CTHI-150B），育王框，育王杯，移蟲針，蜂王漿，注射器，培養(yǎng)皿，封口膜，針式囚王籠。意大利蜜蜂飼養(yǎng)在福建農(nóng)林大學蜂學學院。

1.2 方法

1.2.1 方法A：在蜂卵孵化前（約68 h）將其轉(zhuǎn)移到蜂群中的育王杯進行育王培養(yǎng)

具體步驟如下：① 組織育王蜂群。選取1群強群作為育王群，用毛筆蘸取新鮮的蜂王漿均勻涂在育王框上的育王杯中，然后放入繼箱中部，讓蜂群清理24 h。② 移蟲育王。將在實驗室培養(yǎng)箱中即將孵化的小幼蟲，用移蟲針轉(zhuǎn)移到育王杯中。③ 割取王漿杯蜂蠟。移蟲的第3天需要用刀割去王漿杯上的蜂蠟。④加囚王籠。從注射后蜂卵孵化開始算起，第10天用圓形囚王籠罩住王臺。

1.2.2 方法B：蜂卵孵化后在實驗室內(nèi)培養(yǎng)12 h再轉(zhuǎn)移到蜂群中的育王杯進行育王

具體步驟如下：① 組織育王蜂群。選取1群強群作為育王群，用毛筆蘸取新鮮的蜂王漿涂在育王框的育王杯中，然后放入繼箱中部，讓蜂群清理24 h。②收集蜂王漿。另組織蜂群收集移蟲后48 h生產(chǎn)的蜂王漿[10]，-20℃保存。③ 飼喂蜂王漿。由于注射后的蜂卵在發(fā)育過程中會出現(xiàn)蜂卵孵化時間延長的現(xiàn)象，所以不能提前飼喂食物。在蜂卵的發(fā)育時間達到68 h左右時，用注射器將預熱到34.5℃的蜂王漿食物小心地鋪在正在孵化的小幼蟲下方。④ 移蟲育王。將在實驗室培養(yǎng)箱中已經(jīng)孵化的小幼蟲，用移蟲針轉(zhuǎn)移到育王杯中。⑤ 割取王漿杯蜂蠟。移蟲的第3天需要用刀割去王漿杯上的蜂蠟。⑥ 加囚王籠。從注射后蜂卵孵化開始算起，第10天用圓形囚王籠罩住王臺。

1.2.3 方法C：蜂卵孵化后在實驗室內(nèi)培養(yǎng)12 h再通過復移方式轉(zhuǎn)移到育王杯育王

具體步驟如下：① 組織育王蜂群。選取1群強群作為育王群，用毛筆蘸取新鮮的蜂王漿涂在育王框的育王杯中，然后放入繼箱中部，讓蜂群清理24 h。② 收集蜂王漿。另組織蜂群收集移蟲后48 h生產(chǎn)的蜂王漿[10]，-20℃保存。③ 飼喂蜂王漿。由于注射后的蜂卵在發(fā)育過程中會出現(xiàn)蜂卵孵化時間延長的現(xiàn)象，所以不能提前飼喂食物。在蜂卵的發(fā)育時間達到68 h左右時，用注射器將預熱到34.5℃的蜂王漿食物小心地鋪在正在孵化的小幼蟲下方。④ 移蟲。選取1～2日齡左右自然狀態(tài)下蜂群中的小幼蟲，用移蟲針轉(zhuǎn)移到育王杯中。⑤ 復移育王。第2天除去未被接收的育王杯，同時移出已被接收的小幼蟲。將培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的小幼蟲用移蟲針轉(zhuǎn)移到已被移除幼蟲的育王杯中，在實驗室培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后放入蜂群。⑥ 割取王漿杯蜂蠟。復移的第3天需要用刀割去王漿杯上的蜂蠟。⑦ 加囚王籠。從注射后蜂卵孵化開始算起，第10天用圓形囚王籠罩住王臺。

2 結(jié)果與分析

由表1可以看出，方法C的育王效果最好，接受率達到38%；方法B次之，接受率為9.1%；方法A最低，接受率僅為1.1%。方法A直接將即將孵化的蜂卵轉(zhuǎn)移到育王杯中，第2天檢查發(fā)現(xiàn)只有1個小幼蟲被接收，其余全被蜜蜂清理。原因一方面可能在于蜂卵長時間在培養(yǎng)箱中發(fā)育，沒有蜂群的氣味，所以被蜜蜂當作異物清理掉了；另一方面可能是因為轉(zhuǎn)移蜂卵會造成物理上的損傷。方法B先將剛孵化的小幼蟲在實驗室培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，然后再轉(zhuǎn)移到蜂群中育王。與方法A中轉(zhuǎn)移粘立在巢礎(chǔ)條上的蜂卵相比，方法B中的轉(zhuǎn)移漂浮在蜂王漿上的小幼蟲會減小對幼蟲的物理傷害，而且操作起來也很便捷。方法C比方法B多了1步復移，這樣做的目的是利用蜂群本身生產(chǎn)的蜂王漿去飼喂小幼蟲，一方面可以讓小幼蟲接觸到蜂群中的氣味有利于工蜂接收，另一方面也有利于小幼蟲發(fā)育成蜂王。

表1 將注射后的蜂卵培育成蜂王的3種方法比較

3 結(jié)論與討論

本試驗是在注射后蜂卵的孵化率達到80%的基礎(chǔ)上進行的，注射后蜂卵的培養(yǎng)條件為溫度34℃，濕度98%[5]。在蜂卵注射的基礎(chǔ)上，我們比較了3種將注射后的蜂卵培育成蜂王的方法。在本實驗中，影響蜂卵或小幼蟲被接收的主要因素有2個：其一是蜂卵或小幼蟲長時間在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，體表上已經(jīng)缺少蜂群的氣味信息，轉(zhuǎn)移到蜂群中很容易被蜂群中的蜜蜂清理掉[11]；其二是若直接轉(zhuǎn)移蜂卵或小幼蟲很容易造成較大的物理傷害，因為蜂卵在孵化前后抵抗力很弱，而小幼蟲的體色接近透明，粘在培養(yǎng)皿上很難轉(zhuǎn)移。鑒于這2個因素，方法C通過先在實驗室培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h待其體色加深漂浮在食物上，解決了小幼蟲轉(zhuǎn)移的問題，然后通過復移的辦法讓小幼蟲在蜂群自身生產(chǎn)的蜂王漿中培養(yǎng)1 h，解決了小幼蟲體表上缺少蜂群氣味的問題，最后達到38%的王臺接受率。盡管目前蜂王的出房率還比較低，原因可能是由于該試驗是在10月中旬完成的，當時的氣溫條件并不適合蜂王的培育[12]，所以才會有這么低的出房率，但是后期可以通過不斷地優(yōu)化實驗條件來提高出房率。

總之，本實驗給出了具體的操作方法用于指導將注射后的蜂卵培育成蜂王。期望后期將實驗條件進一步優(yōu)化，也期望能為CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在蜜蜂領(lǐng)域中的建立提供技術(shù)支持。

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