葛 婧，蔣金花，蔡磊明，*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830052；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所，浙江 杭州310021)

三唑類殺菌劑是目前銷售量最大的一種殺菌劑，其殺菌譜較廣，可用于對擔(dān)子菌、子囊菌及半知菌三大亞門真菌引起的多種病害的防治[1-2]。三唑類殺菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的使用是極其廣泛的，但也存在著一定的風(fēng)險。三唑類殺菌劑中的烯效唑、己唑醇、戊唑醇、丙環(huán)唑和氟環(huán)唑已經(jīng)被美國環(huán)保署列入可能的人類致癌物名單[3]。相關(guān)文獻表明，戊唑醇已被報道對水生環(huán)境生物有毒，并對水生生物可能產(chǎn)生長期不良影響[4]。在我國，苯醚甲環(huán)唑是最重要的水稻真菌病害控制劑之一，其應(yīng)用非常廣泛，半衰期為6 d左右[5]；此外，還有研究表明苯醚甲環(huán)唑?qū)︳~類發(fā)育有不良影響[6]。郭晶[7]測定了17種三唑類殺菌劑以斑馬魚為試驗對象96 h的LC50，其中6種三唑類殺菌劑對斑馬魚為中等毒性，其余11種為低毒。三唑類殺菌劑對魚類的胚胎具有一定的毒性，前期研究發(fā)現(xiàn)烯效唑、戊唑醇、氟哇唑、環(huán)唑醇、己唑醇、睛菌唑、滅菌唑、三唑酮等對斑馬魚胚胎具有明顯的致死、致畸和抑制發(fā)育等不良影響[8-11]。

魚類種群是水生生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分，在水體環(huán)境中，魚類處于體系食物鏈的高營養(yǎng)級，可通過檢測其組織器官和脂肪中富集的污染物對水生生態(tài)系統(tǒng)進行評價。當水生生態(tài)系統(tǒng)中污染物的濃度達到魚類所能承載的閾值，則其生長發(fā)育和生殖行為就會受到影響，甚至死亡，故魚類不僅可以作為污染物的指示生物，也能反映出不同層次上的毒性效應(yīng)[12]。

通過對不同生命階段的斑馬魚進行毒性測試，可以客觀全面地了解該農(nóng)藥對斑馬魚個體甚至種群的影響，同時也可以確定最敏感的生命階段。已有研究表明[11]，斑馬魚早期生命階段較為敏感，應(yīng)值得重視，且Nagel等[13]證實斑馬魚胚胎比斑馬魚成魚更為敏感。因此，探究戊唑醇、丙環(huán)唑和苯醚甲環(huán)唑3種三唑類農(nóng)藥單劑對不同生命階段的斑馬魚的急性毒性，早期生命階段的發(fā)育毒性；以及3種三唑類殺菌劑兩兩聯(lián)合使用時對斑馬魚早期生命階段的聯(lián)合毒性對這3種三唑類殺菌劑的使用有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實驗生物與飼養(yǎng)條件

斑馬魚親魚種魚購買自武漢水生生物研究所，AB品系，在本實驗室飼養(yǎng)超過1年，試驗中所用到的斑馬魚成魚和胚胎均為其后代。光周期為14 h∶10 h，每日早晚兩次飼喂豐年蝦。斑馬魚成魚由實驗室親魚產(chǎn)卵獲得，以親魚相同的飼養(yǎng)條件進行飼養(yǎng)3個月以上，達到性成熟后進行試驗。斑馬魚仔魚由實驗室親魚產(chǎn)卵獲得，在胚胎孵化后72 h 進行試驗。斑馬魚胚胎由實驗室親魚(AB品系)產(chǎn)卵獲得。

1.2 藥品與試劑

戊唑醇原藥、丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑(含量>90%，北京廣源益農(nóng)化學(xué)有限責(zé)任公司)。助劑為DMSO(上海生工有限責(zé)任公司)。分別稱取0.11 mg的戊唑醇、丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑原藥，分別放入10 mL容量瓶中，以DMSO為助劑，將原藥配制成濃度為10 000 mg·L-1的母液備用。進行實驗時將母液進一步用水逐級稀釋至指定濃度。

1.3 急性毒性試驗

1.3.1 斑馬魚胚胎的急性毒性試驗

參考OECD[14]的方法，采用“半靜態(tài)法”進行試驗，每24 h更換1次藥液。戊唑醇對斑馬魚胚胎急性毒性試驗濃度為15.00、9.38、5.86、3.66、2.29、1.43、0.89 mg·L-1，丙環(huán)唑?qū)Π唏R魚胚胎急性毒性試驗濃度為24.00、15.00、9.38、5.86、3.66、2.29、1.43、0.89 mg·L-1，苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚胚胎急性毒性試驗濃度為5.00、3.13、1.95、1.21、0.76、0.48、0.30 mg·L-1。設(shè)助劑為對照組。收集斑馬魚胚胎，將受精的胚胎放入24孔板中，每孔加一枚胚胎，加試驗藥液至每孔的2/3處。每24孔板為1重復(fù)，整個試驗設(shè)置3組重復(fù)，將加好胚胎和試驗藥液的孔板放入人工氣候培養(yǎng)箱，溫度為26 ℃，光周期為14 h∶10 h，分別在暴露后6、24、48、72、96 h，按照Nagle等[13]提出的死亡終點進行胚胎死亡的統(tǒng)計，死亡終點為卵凝結(jié)、發(fā)育停滯、無法觀測心跳等。

1.3.2 斑馬魚仔魚的急性毒性試驗

參考OECD[14]的方法，采用“半靜態(tài)法”進行試驗，每24 h更換1次藥液。戊唑醇對斑馬魚仔魚急性毒性試驗濃度為5.20、4.00、3.08、2.37、1.82、1.40、1.08 mg·L-1，丙環(huán)唑?qū)Π唏R魚仔魚急性毒性試驗濃度為5.00、4.17、3.47、2.89、2.41、2.01、1.67 mg·L-1，苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚仔魚急性毒性試驗濃度為3.00、2.30、1.77、1.37、1.05、0.81 mg·L-1。設(shè)助劑為對照組。斑馬魚仔魚為斑馬魚胚胎孵化獲得，取72 h后孵化的仔魚進行急毒試驗。將斑馬魚仔魚放入24孔板中，每孔加1條仔魚，加試驗藥液至每孔的2/3處。每個24孔板為1重復(fù)，整個試驗設(shè)置3組重復(fù)，將加好仔魚和試驗藥液的孔板放入人工氣候培養(yǎng)箱，溫度為26 ℃，光周期為14 h∶10 h，分別在暴露后6、24、48、72、96 h觀察斑馬魚仔魚死亡數(shù)量和中毒癥狀。在體式顯微鏡下無法觀測到心跳即判定為死亡。

1.3.3 斑馬魚成魚的急性毒性試驗

參考OECD[14]的方法，采用“半靜態(tài)法”進行試驗，每24 h更換1次藥液。戊唑醇對斑馬魚成魚急性毒性試驗濃度為8.00、5.33、3.56、2.37、1.58、1.05 mg·L-1，丙環(huán)唑?qū)Π唏R魚成魚急性毒性試驗濃度為4.00、2.67、1.78、1.19、0.79、0.53 mg·L-1，苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚成魚急性毒性試驗濃度為3.00、2.50、2.08、1.14、1.45、1.21 mg·L-1，設(shè)助劑為對照組。取3月齡的斑馬魚成魚，采用6 L魚缸，每缸10條魚，均設(shè)2次重復(fù)，溫度為26 ℃，光周期為14 h∶10 h，分別在暴露后6、24、48、72、96 h觀察斑馬魚成魚死亡數(shù)量和中毒癥狀。死亡標準為：用玻璃棒輕觸受試魚體無應(yīng)激反應(yīng)，并觀察受試魚鰓部無呼吸活動，即判定為死亡。

1.4 聯(lián)合毒性試驗

根據(jù)急性毒性試驗結(jié)果，分別按照毒性比1∶1和濃度比1∶1設(shè)置戊唑醇、丙環(huán)唑和苯醚甲環(huán)唑兩兩聯(lián)合時的試驗濃度進行聯(lián)合毒性試驗。試驗方法與急性毒性試驗相同。聯(lián)合毒性效應(yīng)按改進的Marking聯(lián)合效應(yīng)的相加指數(shù)法(Additional Index)[15]進行評定。

1.5 胚胎發(fā)育試驗

胚胎發(fā)育試驗暴露方法與胚胎毒性試驗相同，參考OECD[16]的方法，戊唑醇對斑馬魚胚胎發(fā)育試驗濃度為3.80、1.90、0.95、0.48、0.24 mg·L-1，丙環(huán)唑?qū)Π唏R魚胚胎發(fā)育試驗濃度為8.25、4.13、2.06、1.03、0.52 mg·L-1，苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚胚胎發(fā)育試驗濃度為1.47、0.74、0.37、0.18、0.09 mg·L-1。以24孔板為試驗容器，每個24孔板為1個重復(fù)，整個試驗設(shè)置3個重復(fù)，暴露時間為6 d。

參考Nagel等[13]提出的毒理指標，用倒置顯微鏡觀察其致死效應(yīng)、亞致死效應(yīng)和致畸效應(yīng)。其中，亞致死效應(yīng)的觀察統(tǒng)計包括：每天觀察所有胚胎的發(fā)育情況，每天統(tǒng)計孵化的仔魚數(shù)量，計算孵化率，每24 h更換的藥液；24 h時，從每重復(fù)隨機取5粒有活性的卵，在倒置顯微鏡下觀察斑馬魚胚胎自主運動情況，并記錄20 s內(nèi)自主運動的次數(shù)；分別在48和96 h時，在倒置顯微鏡下觀察斑馬魚心跳情況，每個重復(fù)隨機取5?；盥?，記錄20 s內(nèi)心跳次數(shù)[17]。

1.6 試驗水樣分析

試驗用水為曝氣自來水，充分曝氣，溶解氧在6.5～7.5 mg·L-1，pH值為6.85，水質(zhì)總硬度在85.32 mg·L-1。在第一次配好藥液和第1次換藥時，從每個處理取10 mL水樣進行濃度分析。

儀器設(shè)備。LCMS 8050超高效液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，(UPLC-MS/MS，日本島津公司)，AB104-S電子天平(感量0.0001，梅特勒-托利多國際貿(mào)易上海有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士 BUCHI)。

化學(xué)試劑。色譜純乙腈(薩勞公司)、色譜純甲醇(薩勞公司)飲用純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)、色譜純甲酸(Anaqua Chemicals Supply公司)

1.6.1 戊唑醇檢測條件

樣品處理。用甲醇-水(1∶1)稀釋樣品，使樣品濃度稀釋至標準曲線范圍內(nèi)，過0.22 μm濾膜，待檢測。

液相色譜條件。色譜柱Kinetex 2.6u XB-C18100A(100 mm×2.1 mm)；流動相甲醇(0.1%甲酸):超純水=80∶20；流速0.25 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣體積2.00 μL。

質(zhì)譜條件。毛細管電壓4.0 kV；霧化氣流速3.0 L·min-1；干燥氣流速10.0 L·min-1；Interface溫度300 ℃；DL溫度250 ℃；Heat Block溫度400 ℃；采用MRM多反應(yīng)監(jiān)測，電離方式為正離子電離(ESI+)；戊唑醇定量離子對為308.2>70.1，定性離子對為256.05>209.05。

1.6.2 丙環(huán)唑檢測條件

樣品處理。移取水樣5.00 mL置于10 mL容量瓶中，用乙腈(色譜純)定容，渦旋30 s后，過0.22 μm濾膜，若濃度超出標準曲線范圍，需用乙腈稀釋后再過0.22 μm濾膜，待檢測。

液相色譜條件。色譜柱ACQUITY UPLCTMNEH C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相乙腈∶甲酸=85∶15；流速0.20 mL·min-1；柱溫40 ℃；進樣體積3.00 μL。

質(zhì)譜條件。毛細管電壓4.0 kV；霧化氣流速3.0 L·min-1；干燥氣流速10.0 L·min-1；Interface溫度300 ℃；DL溫度250 ℃；Heat Block溫度400 ℃；采用MRM多反應(yīng)監(jiān)測，電離方式為正離子電離(ESI+)；丙環(huán)唑定量離子對為342.05>159.01，定性離子對為342.05>205.10。

1.6.3 苯醚甲環(huán)唑檢測條件

樣品處理。用甲醇-水(1∶1)稀釋樣品，使樣品濃度稀釋至標準曲線范圍內(nèi)，過0.22 μm濾膜，待檢測。

液相色譜條件。色譜柱ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm ×100 mm×1.7 μm)；流動相甲醇(0.1%甲酸):超純水=80∶20；流速0.25 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣體積3.00 μL。

質(zhì)譜條件。毛細管電壓4.0 kV；霧化氣流速3.0 L·min-1；干燥氣流速10.0 L·min-1；Interface溫度300 ℃；DL溫度250 ℃；Heat Block溫度400 ℃；采用MRM多反應(yīng)監(jiān)測，電離方式為正離子電離(ESI+)；苯醚甲環(huán)唑定量離子對為406.1>251.0，定性離子對為406.1>337.1。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS 19.0對所得數(shù)據(jù)進行分析，采用One-Way ANOVA 法進行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗藥液濃度分析

由表1—3可以看出，實測濃度與理論濃度的偏差均小于20%，根據(jù)OECD導(dǎo)則[14，16，18]，本試驗中理論濃度可以代表實際濃度。

表1 戊唑醇暴露藥液實測試驗濃度Table 1 Chemical analysis result of tebuconazole solution

“-”表未檢出。下同。
“-” represents no detection. The same as below.

表2 丙環(huán)唑暴露藥液實測試驗濃度Table 2 Chemical analysis result of propiconazole solution

2.2 急性毒性試驗

急性毒性結(jié)果表明，戊唑醇對斑馬魚胚胎96 h LC50值為3.75 mg·L-1；丙環(huán)唑?qū)Π唏R魚胚胎的96 h LC50值為8.25 mg·L-1；苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚胚胎96 h LC50值為1.51 mg·L-1。戊唑醇對斑馬魚仔魚96 h LC50值為3.39 mg·L-1；丙環(huán)唑?qū)Π唏R魚仔魚96 h LC50值為1.90 mg·L-1；苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚仔魚96 h LC50值為1.35 mg·L-1。戊唑醇對斑馬魚成魚96 h LC50值為5.33 mg·L-1；丙環(huán)唑?qū)Π唏R魚成魚96 h LC50值為1.93 mg·L-1；苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚成魚96 h LC50值為2.08 mg·L-1。根據(jù)《GB/T 27861—2011 化學(xué)品 魚類急性毒性試驗》[19]中毒性等級標準判定，這3種三唑類殺菌劑對斑馬魚各生命階段的毒性均為中毒。

戊唑醇、丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚不同生命階段均有一定的致死效應(yīng)。根據(jù)96 h-LC50(表4)，斑馬魚3個生命階段對戊唑醇的敏感順序為仔魚(3.39 mg·L-1)>胚胎(3.75mg·L-1)>成魚(5.33 mg·L-1)；斑馬魚3個生命階段對丙環(huán)唑的敏感順序為仔魚(1.90 mg·L-1)>成魚(1.93 mg·L-1)>胚胎(8.25 mg·L-1)；斑馬魚3個生命階段對苯醚甲環(huán)唑的敏感順序為仔魚(1.35 mg·L-1)>胚胎(1.51 mg·L-1)>成魚(2.08 mg·L-1)。可以看出，仔魚階段對戊唑醇、丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑這3種三唑類殺菌劑最為敏感。

表3 苯醚甲環(huán)唑暴露藥液實測試驗濃度Table 3 Chemical analysis result of difenoconazole solution

表4 戊唑醇、丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚不同生命階段的急性毒性Table 4 Acute toxicity of tebuconazole，propiconazole and difenoconazole on zebrafish at different stages of life

2.3 聯(lián)合毒性試驗

在急性毒性相同的試驗條件下，戊唑醇、丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑采用濃度比1∶1和毒性比1∶1兩種配比方式進行兩兩聯(lián)合毒性試驗。

2.3.1 胚胎聯(lián)合毒性試驗

由圖5—7可知，戊唑醇和丙環(huán)唑采用濃度比1∶1和毒性比1∶1對斑馬魚胚胎進行聯(lián)合毒性試驗時，相加指數(shù)AI值分別為-0.44和-0.98。聯(lián)合毒性表現(xiàn)為拮抗作用。戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑采用濃度比1∶1和毒性比1∶1對斑馬魚胚胎進行聯(lián)合毒性試驗時，相加指數(shù)AI值分別為-0.65和-0.43，聯(lián)合毒性表現(xiàn)為拮抗作用。苯醚甲環(huán)唑和丙環(huán)唑采用濃度比1∶1和毒性比1∶1對斑馬魚胚胎進行聯(lián)合毒性試驗時，相加指數(shù)AI值分別為0.18和0.22，聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用。

表5 戊唑醇和丙環(huán)唑?qū)Π唏R魚胚胎聯(lián)合毒性Table 5 Combined toxicity of tebuconazole and propiconazole on zebrafish embryos

表6 戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚胚胎聯(lián)合毒性Table 6 Combined toxicity tebuconazole and difenoconazole of on zebrafish embryos

表7 苯醚甲環(huán)唑和丙環(huán)唑?qū)Π唏R魚胚胎聯(lián)合毒性Table 7 Combined toxicity difenoconazole and propiconazole of on zebrafish embryos

表9 戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚仔魚聯(lián)合毒性Table 9 Combined toxicity tebuconazole and difenoconazole of on zebrafish larvae

表10 丙環(huán)唑和苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚仔魚聯(lián)合毒性Table 10 Combined toxicity difenoconazole and propiconazole of on zebrafish embryos larvae

2.3.2 仔魚聯(lián)合毒性試驗

由圖8—10可知，戊唑醇和丙環(huán)唑采用濃度比1∶1和毒性比1∶1對斑馬魚仔魚進行聯(lián)合毒性試驗時，相加指數(shù)AI值分別為-0.51和-0.17，聯(lián)合毒性表現(xiàn)為拮抗作用。戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑采用濃度比1∶1和毒性比1∶1對斑馬魚仔魚進行聯(lián)合毒性試驗時，相加指數(shù)AI值分別為-0.01和-0.05，聯(lián)合毒性表現(xiàn)為拮抗作用。苯醚甲環(huán)唑和丙環(huán)唑采用濃度比1∶1和毒性比1∶1對斑馬魚胚胎進行聯(lián)合毒性試驗時，相加指數(shù)AI值分別為0.08和0.37，聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用。

2.4 胚胎發(fā)育試驗

2.4.1 不同殺菌劑對胚胎的抑制作用

戊唑醇、丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚胚胎孵化率的影響如圖1所示。3.80、1.90、0.95、0.48、0.24 mg·L-1的戊唑醇處理組斑馬魚胚胎的孵化率分別為68.75%、87.50%、89.58%、93.75%、100.00%。8.25、4.13、2.06、1.03、0.52 mg·L-1的丙環(huán)唑處理組斑馬魚胚胎的孵化率分別為6.25%、37.50%、70.83%、85.42%、87.50%。1.47、0.74、0.37、0.18、0.09 mg·L-1的苯醚甲環(huán)唑處理組斑馬魚胚胎的孵化率分別為47.92%、77.08%、89.58%、89.58%、97.92%。助劑對照組對斑馬魚的孵化率沒有影響。根據(jù)胚胎發(fā)育試驗結(jié)果可以看出，在這3種三唑類殺菌劑中，濃度較低的苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚胚胎的孵化有一定的抑制，斑馬魚胚胎孵化受到抑制的敏感順序為苯醚甲環(huán)唑>丙環(huán)唑>戊唑醇。

由圖1可知，在染毒96 h后，斑馬魚胚胎的孵化率保持恒定。對照組和試驗設(shè)計中的低濃度暴露組從48 h開始出現(xiàn)完成孵化的個體，在96 h時絕大部分存活的胚胎均完成孵化，但在144 h時，試驗設(shè)計中的高濃度暴露組中仍觀測到有胚胎完成孵化。

圖1 不同殺菌劑對斑馬魚胚胎孵化率的影響Fig.1 Effect of different germicides on hatching rate of zebrafish embryos

2.4.2 不同殺菌劑對胚胎自主運動和心跳的影響

自主運動是脊柱神經(jīng)元刺激產(chǎn)生的運動，主要表現(xiàn)形式為斑馬魚尾部自發(fā)地從一邊到另一邊的交替運動[20]。斑馬魚胚胎發(fā)育到24 h時，會出現(xiàn)有規(guī)律的自主運動。自主運動統(tǒng)計結(jié)果表明，戊唑醇、丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑3種三唑類殺菌劑在不同劑量的暴露下均能抑制斑馬魚胚胎24 h自主運動，隨著暴露濃度的升高，斑馬魚胚胎自主運動受到的抑制越明顯。

如圖2所示，0.52 mg·L-1的丙環(huán)唑?qū)Π唏R魚胚胎的自主運動的抑制不明顯，1.47、0.74 mg·L-1的苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚胚胎的自主運動的抑制有極顯著抑制，0.37、0.18、0.09 mg·L-1的苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚胚胎的自主運動的抑制不明顯。

心跳次數(shù)受到的抑制與對自主運動的影響趨勢類似，戊唑醇、丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑3種三唑類殺菌劑在不同劑量的暴露下對斑馬魚胚胎的心跳影響也存在抑制作用。試驗中高濃度處理組受到顯著抑制。如圖2所示，不同濃度的戊唑醇、丙環(huán)唑和苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚48 h和96 h的心跳次數(shù)的抑制有極顯著差異。

無相同大寫或小寫字母表示組間差異極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)。下同The values without the same capital or lowercase letters indicate extremely significant (P<0.01) or significant difference among groups(P<0.05).The same as below.圖2 不同殺菌劑對斑馬魚胚胎自主運動和心跳的影響Fig.2 Effects of different germicides on fetal heartbeat and autonomic motility of zebrafish

3 討論

急性毒性試驗結(jié)果表明，戊唑醇、丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑?qū)τ诎唏R魚的3個生命階段均有致死能力，且仔魚所在的早期生命階段最為敏感。目前很多研究發(fā)現(xiàn)，水生生物早期生命階段對化學(xué)物質(zhì)的敏感性要高于成魚階段[17]。而硬骨魚的胚胎和仔魚階段同樣被認為是魚類生命周期中最為敏感的階段[21-23]，原因之一是硬骨魚在胚胎階段很可能不具備像成年個體那樣的代謝解毒能力[20]。胚胎階段的敏感程度低于仔魚階段，可能是由于胚胎有胚胎膜的保護。有研究表明，斑馬魚胚胎膜可以防止部分物質(zhì)滲入[24]。仔魚階段最為敏感，這可能是因為處于該階段的斑馬魚既未完成生長發(fā)育，又沒有胚胎膜的保護[17]。戊唑醇、丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑3種三唑類殺菌劑對斑馬魚毒性影響涵蓋了斑馬魚生長的整個生命周期，所得結(jié)果可以為這3種三唑類殺菌劑的毒性效應(yīng)以及生態(tài)風(fēng)險評價提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。當前農(nóng)藥毒性評價均以成魚為試驗對象，只能得到農(nóng)藥對成魚的毒性效應(yīng)，而仔魚所在的早期生命階段與成魚相比更加敏感，所以，農(nóng)藥對魚類早期生命階段的毒性效應(yīng)更應(yīng)受到重視。因此，研究這3種三唑類殺菌劑對魚類整個生命階段的影響對其毒性預(yù)測和生態(tài)風(fēng)險評估更加準確。

聯(lián)合毒性試驗結(jié)果表明，戊唑醇和丙環(huán)唑等濃度和等毒性混合與戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑等濃度和等毒性混合對斑馬魚早期胚胎生命階段為拮抗作用，丙環(huán)唑和苯醚甲環(huán)唑等濃度和等毒性混合對斑馬魚早期胚胎生命階段為協(xié)同作用。影響農(nóng)藥聯(lián)合毒性的因素有很多，不同濃度的配比結(jié)果也會不同。有研究表明，戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑在不同濃度的配比下對橡樹炭疽病菌的聯(lián)合毒性效應(yīng)不同，既有拮抗作用也有協(xié)同作用[25]。本文中聯(lián)合毒性試驗僅表示在濃度比1∶1和毒性比1∶1條件下的聯(lián)合毒性效應(yīng)，這3種三唑類殺菌劑在其他濃度配比條件下和其對斑馬魚的聯(lián)合毒性有待研究。采用相加指數(shù)法對聯(lián)合毒性的評價考慮的因素相對單一，聯(lián)合毒性應(yīng)進行多種方法的全面評價。農(nóng)藥的聯(lián)合使用可在一定程度上減少對環(huán)境的污染，有效達到防治病蟲害的結(jié)果，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中采用對防治對象毒性高、對非靶標生物毒性低的組合將更有效的降低農(nóng)藥對環(huán)境的負面影響。

根據(jù)胚胎發(fā)育試驗結(jié)果，戊唑醇、丙環(huán)唑和苯醚甲環(huán)唑這3種三唑類殺菌劑對斑馬魚胚胎發(fā)育有一定的抑制作用，同時也抑制了自主運動和心跳次數(shù)。孵化率與孵化后仔魚的質(zhì)量有著直接關(guān)系[18]，是胚胎發(fā)育階段的重要毒理學(xué)指標。本研究中，斑馬魚胚胎孵化延遲的原因可能是由于農(nóng)藥暴露后，胚胎自身發(fā)育受到農(nóng)藥的抑制，同時斑馬魚胚胎的自主運動也受到了抑制。心臟是斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的第一個功能性器官，同時也是魚類胚胎試驗的重要毒理學(xué)終點[19]。之前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，胚胎發(fā)育過程中心臟是最早發(fā)生并發(fā)揮功能的器官，完整的心臟功能對于胚胎的正常發(fā)育起著關(guān)鍵作用，斑馬魚胚胎發(fā)育至48 hpf心率基本趨于穩(wěn)定[26-27]。而在本研究中，3種三唑類殺菌劑在不同劑量的暴露下，斑馬魚胚胎心率受到明顯抑制，其中，隨著時間的延長，受到的抑制越明顯。

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