袁雪梅，姚嘉赟，藺凌云，潘曉藝，徐 洋，尹文林，沈錦玉

(農業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室，浙江省魚類健康與營養(yǎng)重點實驗室，浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江 湖州 313001)

泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)屬鯉形目，鰍科，是一種雜食性魚類，生長快，分布廣，其味道鮮美，肉質細嫩，營養(yǎng)豐富，被譽為“水中人參”，同時還具有藥用價值，是我國主要淡水經(jīng)濟魚類之一，在國內和國際市場上的需求都很大。為了滿足日益增長的市場需求，泥鰍的人工養(yǎng)殖在全國各地悄然興起，其中江蘇省養(yǎng)殖規(guī)模最大[1]。然而隨著泥鰍養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，病害問題日漸突出。在這些病害中，以由溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)[2]、創(chuàng)傷弧菌(vibriovulnificus)[3]、泥鰍氣單胞菌(Aeromonasmisgurnus)[4]、凡隆氣單胞菌(Aeromonasveronii)[5]等感染引起的細菌性疾病最為嚴重，給養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失。

2015年7月，在浙江省新昌縣一養(yǎng)殖池塘出現(xiàn)了泥鰍批量死亡事件，其癥狀主要表現(xiàn)為下頜、腹部等部位發(fā)紅或可見潰瘍病灶，剖檢可見腹腔內含腹水，呈紅色，腸內無食物，肝、脾腫脹或有不同程度的出血。為查明病原，本研究以典型癥狀的病魚作為材料，對其進行病原菌分離鑒定和藥敏試驗，以期為該病的臨床防治和診斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗魚

患病泥鰍采集自浙江省紹興市新昌縣一個泥鰍養(yǎng)殖場；健康泥鰍購自浙江省湖州市水產(chǎn)品市場，平均體長(10 ± 0.6)cm。

1.1.2 主要試劑

大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA)和藥物敏感試紙購自杭州天和微生物試劑有限公司；細菌16S rDNA基因擴增通用引物合成和基因測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成；PCR擴增試劑為Promega公司的AmpliTaq Gold?360 Master Mix，DNA Marker為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 病魚檢查

隨機取得10尾患病泥鰍。肉眼觀察病魚外表、鰓絲以及內臟器官等的宏觀病理變化，然后取病魚的鰓絲、肝臟和腎臟等器官組織，顯微鏡檢查，排除寄生蟲和霉菌感染的可能性。

1.2.2 病原菌的分離培養(yǎng)

在無菌條件下解剖病魚，接種環(huán)取肝、脾、腎及病灶等不同組織于TSB平板劃線接種培養(yǎng)，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，從形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落中選取單個菌落，再次進行平板劃線，直至獲得純培養(yǎng)。

1.2.3 人工感染試驗

將純化菌株接種到TSB培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水稀釋至9×108、9×107、9×106、9×105cfu·mL-1菌液備用。將暫養(yǎng)1周的健康泥鰍隨機分組，每組10尾，采用腹腔注射法進行人工感染試驗。注射0.1 mL菌懸液，每個實驗組設1個重復，同時設立對照組直接注射無菌生理鹽水，控制水溫為(20 ± 1)℃，飼養(yǎng)觀察14 d，每天記錄發(fā)病癥狀和死亡情況，并對死亡魚進行細菌分離鑒定。

1.2.4 病原菌的鑒定

形態(tài)特征：將病原菌接種于TSA平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察菌落的形態(tài)；挑取單菌落進行革蘭氏染色，油鏡下觀察菌體顏色與形態(tài)。

生理生化鑒定：將純化后的病原菌利用梅里埃公司的VITEK-2全自動鑒定儀進行測試與分析。

16S rRNA與gyrB基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建：① 細菌DNA的制備：挑取28 ℃培養(yǎng)24 h的細菌的單一菌落于50 μL無菌去離子水中，100 ℃水浴10 min后，4 ℃ 10 800g離心5 min，上清即為PCR擴增的模板DNA。② 16S rRNA基因序列的PCR擴增與測序：以提取的基因組為模板進行16S rRNA基因PCR擴增，2個引物分別為27F (5’-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)[6]，擴增序列預期長度為1 500 bp。擴增條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物交由南京金斯瑞生物科技有限公司測序。③gyrB基因序列的PCR擴增與測序：以提取的基因組為模板進行gyrB基因PCR擴增的2個引物分別為gyrB3F(5’-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3’)和gyrB14R(5’-TTGTCCGGGTTGTACTCGTC-3’)[7]，序列預期長度為1 100 bp。擴增條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物交由南京金斯瑞生物科技有限公司測序。④ 16S rRNA和gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹構建：對分離菌的16S rRNA基因和gyrB基因序列通過NCBI的Blast檢索系統(tǒng)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)進行序列同源性分析，使用ClustalX軟件與從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的序列相似性較高的菌株的序列進行多序列匹配排列(multiple alignments)，通過MEGA 4.0(molecular evolutionary genetics analysis，MEGA)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

菌種分類位置確定：根據(jù)細菌形態(tài)、培養(yǎng)及理化特性測定的結果，主要依據(jù)參考伯杰氏鑒定細菌學手冊等[8-9]，并結合細菌16S rRNA和gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育學分析的結果，進行分離菌的種屬分類位置判定。

藥物敏感性測定：經(jīng)鑒定后的菌株，用常規(guī)瓊脂擴散(K-B)法對49種抗菌類藥物的敏感性進行測定，以是否出現(xiàn)抑菌圈及抑菌圈直徑大小作為敏感與耐藥的判定指標[10]。

2 結果與分析

2.1 自然發(fā)病情況

患病泥鰍口、鰓蓋、下頜、軀干部、腹部的皮膚、胸鰭及腹鰭發(fā)紅，隨著病情的發(fā)展，體表出現(xiàn)紅斑，部分病鰍出現(xiàn)全身皮下組織出血，嚴重者出現(xiàn)潰瘍，剖檢可見腹腔內有大量紅色的腹水，腸內無食物，肝、脾腫脹或有不同程度的出血。該病的死亡率可高達60%。

2.2 優(yōu)勢菌的分離

從病魚的病灶中分離獲得1株優(yōu)勢菌株，暫命名為NQ150728。

2.3 人工感染試驗

人工感染試驗結果見表1，由表可知對照組泥鰍在14 d觀察期內均正常。9×108cfu·mL-1試驗組魚于48 h內全部死亡；9×107cfu·mL-1試驗組魚于72 h內全部死亡；9×106cfu·mL-1試驗組魚于5 d內全部死亡；9×105cfu·mL-1試驗組魚在14 d觀察期內有6 尾魚未死亡。感染死亡魚出現(xiàn)明顯的頭部、體表、鰭及鰭基出血，注射部位腫脹出血的現(xiàn)象。取感染死亡魚進行細菌學檢驗，結果均分離到大量純一的與供試菌株(NQ150728)在形態(tài)及菌落特征上相似的菌落。試驗證明，分離菌為本次引起泥鰍大量死亡的病原菌，且對泥鰍具強致病性。

2.4 分離菌株的鑒定

2.4.1 形態(tài)學鑒定

菌株NQ150728在TSA培養(yǎng)基上的菌落中心略凸起，灰白色不透明，圓形光滑，邊緣整齊；經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，該菌為革蘭陰性菌，菌體短桿狀、兩端鈍圓、無芽孢。

2.4.2 生理生化鑒定

生理生化鑒定結果見表 2，初步確定病原菌NQ150728為維氏氣單胞菌Aeromonasveronii。

2.4.3 病原菌16S rRNA與gyrB序列比較及系統(tǒng)進化分析

利用細菌16S rRNA通用引物對NQ150728進行PCR擴增，測序得到1 403 bp的序列，將此序列在美國國家生物技術信息中心上進行Blast同源性分析，GenBank中維氏氣單胞菌相似性均達100%。在GenBank中檢索獲得氣單胞菌屬中標準菌株的16S rRNA序列，運用MEGA6.0軟件的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。由圖1可見，菌株NQ150728與維氏氣單胞菌標準菌株ATCC 35624(系統(tǒng)自帶)等聚為一支。

利用引物gyrB3F，gyrB14R對管家基因gyrB進行擴增，可得到1 036 bp的特異性條帶，在GenBank中檢索獲得氣單胞菌屬中部分標準菌株的gyrB序列，運用軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，菌株NQ150728與維氏氣單胞菌聚為一個分支。16S rRNA與gyrB序列分析結果基本可確定NQ150728為維氏氣單胞菌。

表1 人工感染試驗結果Table 1 Results of artificial infection test

表2 NQ150728菌株的生化鑒定結果Table 2 The biochemical reaction results of strain NQ150728

+，陽性；-，陰性；F，發(fā)酵型。
+，Positive; -，Negative; F，F(xiàn)ermentation.

2.5 藥物敏感性試驗

菌株NQ150728對49種抗菌類藥物的藥敏結果見表3。結果表明，該菌對頭孢曲松、利福平、恩諾沙星、四環(huán)素、氯霉素、頭孢哌酮、氧氟沙星、洛美沙星、克拉霉素、頭孢噻吩、多西環(huán)素、新霉素、頭孢他啶、大觀霉素、環(huán)丙沙星、呋喃妥因、頭孢拉定、氟羅沙星、甲氧嘧啶、米諾環(huán)素、頭孢氨芐、氨曲南、左氟沙星、甲氧胺嘧啶等24種藥物高度敏感，對鏈霉素、卡那霉素、紅霉素、妥布霉素等10種藥物中度敏感，對青霉素G、多粘菌素B、氨芐西林、克林霉素等15種藥物耐藥。與已報道的其他水產(chǎn)動物維氏氣單胞菌的藥敏試驗[11-14]進行了對比，不同生物來源的維氏氣單胞菌對藥物的敏感性不盡相同，但是不同來源的菌株均對環(huán)丙沙星、諾氟沙星和氧氟沙星敏感，對青霉素G和氨芐西林耐藥(表4)。

3 討論

維氏氣單胞菌分布廣泛、致病性較強，是一種常見的人-畜-魚共患致病菌[11]，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和人類的健康構成了嚴重的威脅。該菌可感染并引起水產(chǎn)動物的大量死亡；人食用了污染的水產(chǎn)品、蔬菜和畜禽肉類時，可引發(fā)腹瀉、腦膜炎和敗血癥等，免疫力低下的患者甚至可能死于該菌的感染[15]。在國內，該菌可感染大鯢、華鯪、黃顙魚、框鏡鯉等水產(chǎn)動物，給養(yǎng)殖者帶來很大的經(jīng)濟損失[11]。目前，有關泥鰍維氏氣單胞菌感染的報道已有2例，分別發(fā)生在連云港的東海[5]和墩尚鎮(zhèn)[16]，報道中泥鰍癥狀以出血潰瘍?yōu)橹?，且死亡率高達60%，與本研究中情況相似。

圖1 NQ150728菌株16S rRNA基因序列發(fā)育進化樹Fig.1 16S rRNA gene sequence of strain NQ150728

圖2 NQ150728菌株gyrB基因序列發(fā)育進化樹Fig.2 Gene sequence of gyrB of strain NQ150728

表3 NQ150728菌株的藥物敏感性試驗結果Table 3 Antibiotic sensitivity test of strain NQ150728

抑菌圈直徑包括藥敏紙片直徑 7 mm。R(耐藥)，7 mm≤抑菌圈直徑≤14 mm；S(敏感)，抑菌圈直徑≥20 mm；I(中介)，15 mm≤抑菌圈直徑≤19 mm。
Antibacterial circle diameter includes 7 mm of the drug sensitive disk diameter. R (resistant) represents 7 mm≤antibacterial circle diameter ≤14 mm; S (sensitive) represents antibacterial circle diameter ≥20 mm; I (intermediary) represents 15 mm≤antibacterial circle≤19 mm. PLY，Polymyxin; SM，Streptomycin; AMP，Ampicillin; ENR，Enrofloxacin; TET，Tetracycline; TOB，Tobramycin; SMZ，Sulfamethoxazole; CIP，Ciprofloxacin; NOR，Norfloxacin; FZD，F(xiàn)urazolidone; GEN，Gentamicin; KAN，Kanamycin; OFL，Ofloxacin; DOX，Doxycycline; CAZ，Ceftazidime; PNC，Penicillin; PLY，Polymyxin; CTRX，Ceftriaxone; CLDM，Clindamycin; RFP，Rifampicin; CAP，Chloramphenicol; ERY，Erythromycin; LML，Lomefloxacin; CPZ，Cefoperazone; AZI，Azithromycin; CLA，Clarithromycin; ENX，Enoxacin; LIN，Lincomycin; FLX，F(xiàn)leroxacin; ROX，Roxithromycin; AMO，Amoxicillin; Ac-SPM，Acetyl spiramycin; SMM，Sulfamethoxydiazine; OXA，Oxacillin; AMK，Amikacin; MET，methoxypyrimidine; VAN，Vancomycin; CEP，Cephalothin; AZL，Azlocillin; BAC，Bacitracin; LVF，Levofloxacin; AZT，Aztreonam; CEF，Cephalexin; MINO，Minocycline; CEP，Cephradine; MYCIN，Midecamycin; SPE，Spectinomycin; FUR，furadantin; NOV，Novobiocin.

藥物敏感試驗結果可為維氏氣單胞菌感染防治提供一些科學依據(jù)，本次以49種常用抗菌類藥物對分離鑒定的維氏氣單胞菌進行了藥物敏感性測定，結果表明，分離菌對頭孢曲松、利福平、恩諾沙星、四環(huán)素等24種藥物高度敏感；對青霉素G、對黏菌素B、氨芐西林、克林霉素等15種藥物耐藥；對鏈霉素、卡那霉素、紅霉素、妥布霉素素等10種藥物中度敏感。而綜合已有對維氏氣單胞菌的藥物敏感性方面的研究[11-14]，顯示該菌不同菌株存在較大的耐藥差異性，需在選擇用藥治療相應疾病時加以注意，考慮到維氏氣單胞菌的耐藥差異性及細菌對抗菌類藥物耐藥變異頻繁的特征，應針對不同生物來源的菌株進行針對性的藥物篩選試驗，選擇最有效的藥物進行治療或預防，可防止細菌抗藥性的產(chǎn)生。本次實驗選用抗生素的種類較多，有一些為禁用藥物，如紅霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星等，目的為研究NQ150728菌株的藥物敏感性，其中可用藥物可供臨床參考。目前在養(yǎng)殖過程中誤用、濫用抗生素和消毒劑等，加劇了水體中微生態(tài)的失衡，導致耐藥性菌株的出現(xiàn)。但是合理選擇和使用有效的抗生素仍是目前和近期內控制疾病的主要方法，不能一概否定。

S為敏感；I為中度敏感；R為耐藥；“—”表示本實驗使用的抗生素他人未使用。
S represents sensitive; I represents intermediary; R represents resistant; “—” represents the antibiotics used in this study but were not used in the references.

微生物自動鑒定和基因型同源性分析方法具有簡捷、高效、特異等優(yōu)點，已廣泛應用于現(xiàn)代細菌診斷領域[17-19]。VITEK-2全自動微生物鑒定儀是梅里埃公司的產(chǎn)品，是目前世界上影響力較大的細菌鑒定和藥敏系統(tǒng)之一[20]，其數(shù)據(jù)庫中微量的生化反應包括了傳統(tǒng)的生理生化測定分析，簡化了傳統(tǒng)實驗摸索過程，避免人工操作造成的誤差，已被多個國家的官方檢疫機構認可[19]。本實驗應用VITEK-2全自動微生物鑒定儀對泥鰍病原菌進行生化鑒定，耗時6.25 h，檢測效率得以顯著提高，且鑒定結果評價為極好的鑒定，證實鑒定結果準確。同時構建的細菌16S rRNA 及gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，該菌與維氏氣單胞菌自然聚合為一支，可信度100%。對菌株NQ150725的分子生物學的鑒定也進一步證實了VITEK-2全自動微生物鑒定儀的準確性，適于在漁業(yè)生產(chǎn)中推廣應用。

參考文獻(References)：

[1] 農業(yè)部漁業(yè)局.2015中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒[M].北京：中國農業(yè)出版社，2015.

[2] 肖克宇，蔣武成，李年文，等. 泥鰍腐皮病的病原與防治的研究[J]. 湖南農學院學報，1992，18(增刊l)：20-25.

XIAO K Y，JIANG W C，LI N W，et al. Stigmatosis of Misgurnus anguillicaudatus and its pathogenic bacteria[J].JournalofHunanAgriculturalcollege，1992，18(Sl)：20-25.(in Chinese with English abstract)

[3] 楊鳶劼，陳輝，金日奉，等. 泥鰍潰瘍病的病原菌分離和組織病理學觀察[J]. 集美大學學報(自然科學版)，2004，9(1)：22-25.

YANG Y J，CHEN H，JIN R F，et al. Isolation of the pathogens and histopathological study on ulcer disease of loach[J].JournalofJimeiUniversity(NaturalScience)，2004，9(1)：22-25. (in Chinese with English abstract)

[4] 房海，陳翠珍，張曉君，等. 泥鰍氣單胞菌感染的檢驗與分析[J]. 中國人獸共患病雜志，2006，22(11)：1065-1069.

FANG H，CHEN C Z，ZHANG X J，et al. Examination and analysis on an infection due toAeromonasmisgurnus[J].ChineseJournalofZoonoses，2006，22(11)：1065-1069. (in Chinese with English abstract)

[5] 秦蕾，徐靜，張曉君，等. 泥鰍的凡隆氣單胞菌感染[J]. 中國人獸共患病雜志，2008，24 (12)：1100-1102.

QIN L，XU J，ZHANG X J，et al. Infection withAeromonasveroniibiovar. inMisgurnusanguillicaudatus[J].ChineseJournalofZoonoses，2008，24 (12)：1100-1102. (in Chinese with English abstract)

[6] POLZ M F，CAVANAUGH C M. Bias in template to product ratios in multitemplate PCR[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology，1998，64(10)：3724-3730.

[8] HOLT J G，KRIEG N R，SNEATH P H A，et al. Bergey’s manual of determinative bacteriology[M]. 9th Ed. London: Williams and Wilkins，Baltimore，1994:190-191，253.

[9] KRIEG N R，HOLT J G. Bergey’s manual of systematic bacteriology[M]. London: Williams and Wilkins，Baltimore，1984:545-548.

[10] 葉應嫵，王毓三. 全國臨床檢驗操作規(guī)程[M]. 2版. 南京：東南大學出版社，1997:553-562.

[11] 徐洋，藺凌云，姚嘉赟，等. 黃顙魚“潰瘍綜合征”病原的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 淡水漁業(yè)，2015，45(5)：100-104.

XU Y，LING L Y，YAO J Y，et al. Pathogen isolation，identification and susceptibility test of ulcerative disease syndrome onPelteobagrusfulvidraco[J].FreshwaterFisheries，2015，45(5)：100-104. (in Chinese with English abstract)

[12] 房海，陳翠珍，張曉君，等. 中華絨螯蟹病原維氏氣單胞菌的檢驗[J]. 中國人獸共患病學報，2008，24 (1)：45-49.

FANG H，CHEN C Z，ZHANG X J，et al. Examination of the pathogenicAeromonasveroniiisolated from crabEriocheirsinensis[J].ChineseJournalofZoonoses，2008，24 (1)：45-49. (in Chinese with English abstract)

YANG Z X，ZHOU Y，REN R Y，et al. Isolation，identification and drug susceptibility test ofAeromonasveroniifromLiobagrusmarginatusGiinther[J].ChineseJournalofVeterinaryMedicine，2012，39(2)：92-96. (in Chinese with English abstract)

[14] 李聰，蔡巖，周永燦，等. 海南羅非魚致病性維氏氣單胞菌分離鑒定及藥敏特性研究[J]. 水產(chǎn)科學，2015，34(10)：640-646.

LI C，CAI Y，ZHOU Y C，et al. Isolation，identification and antibiotic sensitivity ofAeromonasveroniifrom Tilapia cultured in Hainan Province[J].FisheriesScience，2015，34(10)：640-646. (in Chinese with English abstract)

[15] 吳同壘，單曉楓，孟慶峰，等. 維氏氣單胞菌研究進展[J]. 中國獸藥雜志，2011，45(7)：41-44.

WU T L，SHAN X F，MENG Q F，et al. Advances inAeromonasveronii[J].ChineseJournalofVeterinaryMedicine，2011，45(7)：41-44.(in Chinese with English abstract)

[16] ZHU M，WANG X R，LI J，et al. Identification and virulence properties ofAeromonasveroniibv.sobriaisolates causing an ulcerative syndrome of loachMisgurnusanguillicaudatus[J].JournalofFishDiseases, 2016，39(6)：777-781.

[17] 高正勇，曾令兵，孟彥，等. 患病大鯢中弗氏檸檬酸桿菌的分離與鑒定[J]. 微生物學報，2012，52(2)：169-176.

GAO Z Y，ZENG L B，MENG Y，et al. Isolation and identification ofCitrobacterfreundiifrom diseased giant salamander，Andriasdavidianus[J].ActaMicrobiologicaSinica，2012,52(2)：169-176. (in Chinese with English abstract)

[18] 周勇，曾令兵，李瑞偉，等. 患病黃額閉殼龜中產(chǎn)酸克雷伯菌的分離與鑒定[J]. 淡水漁業(yè)，2012，42(3)：38-43.

ZHOU Y，ZENG L B，LI R W，et al. Isolation and identification ofKlebsiellaoxytocafrom diseasedCuoragalbinifrons[J].FreshwaterFisheries，2012，42(3)：38-43. (in Chinese with English abstract)

[19] 安偉，肖雨，高曉華，等. 鱖源致病性熒光假單胞菌的分離與鑒定[J]. 動物學雜志，2014，49(5)：760-765.

AN W，XIAO Y，GAO X H，et al. Isolation and identification of pathogenicPseudomonasfluorescensfromSinipercachuatsi[J].ChineseJournalofZoology，2014，49(5)：760-765. (in Chinese with English abstract)

[20] 吳會桃，蔡芷荷，吳清平，等. 細菌鑒定系統(tǒng)的應用研究進展[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，20(9)：2381-2384.

WU H T，CAI Z H，WU Q P，et al. Advances in the application of bacterial identification system[J].ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology，2010，20(9)：2381-2384. (in Chinese)