周金星，錢兆全，靳二輝，劉文舉，金光明，*

(1.安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100； 2.安徽科技學(xué)院 細(xì)胞與分子生物學(xué)研究中心，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

胸腺是動(dòng)物機(jī)體重要的淋巴器官，也是成熟T淋巴細(xì)胞形成場(chǎng)所，因此其功能狀態(tài)與免疫密切相關(guān)。新生動(dòng)物胸腺被摘除后，可發(fā)生細(xì)胞免疫缺陷[1]。中草藥是我國(guó)的傳統(tǒng)瑰寶，研究表明，許多中藥制劑在促進(jìn)胸腺生長(zhǎng)發(fā)育、維持胸腺生理功能上具有重要作用。梁銳等[2]研究了軍蛭煎劑可增加小鼠胸腺指數(shù)，改善其顯微結(jié)構(gòu)；連翹酯苷能改善由LPS誘導(dǎo)的AA雞胸腺組織抗氧化功能的變化[3]；白術(shù)中的白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ能顯著提高小鼠胸腺指數(shù)及T淋巴細(xì)胞增殖[4]；板藍(lán)根凝集素可促進(jìn)小鼠胸腺的發(fā)育和胸腺細(xì)胞的增殖[5]；黃芪建中湯可顯著提高大鼠胸腺指數(shù)[6]；當(dāng)歸多糖對(duì)拮抗致衰劑對(duì)大鼠胸腺結(jié)構(gòu)與功能具有很好的保護(hù)作用[7]；固本止咳中藥可顯著增加COPD模型小鼠胸腺指數(shù)[8]；紅芪多糖-3可顯著提高大鼠的胸腺指數(shù)[9]；豬苓和豬苓多糖可對(duì)BBN誘導(dǎo)的膀胱癌大鼠胸腺指數(shù)及功能具有較好的保護(hù)作用[10]。

Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，也是執(zhí)行細(xì)胞凋亡最重要的一種蛋白酶[11]。對(duì)于胸腺中凋亡基因的研究，劉春雨等[12]報(bào)道了天府肉鴨發(fā)育過(guò)程中胸腺Bcl-2及Bax基因和蛋白的表達(dá)，姬松茸多糖可以抑制鉛致大鼠胸腺凋亡基因Capase-3表達(dá)的增強(qiáng)[13]，從而保護(hù)胸腺功能。黃芪注射液可以通過(guò)下調(diào)Caspase-3表達(dá)，從而抑制胸腺T淋巴細(xì)胞凋亡，保護(hù)胸腺萎縮，增強(qiáng)胸腺功能[14]。但現(xiàn)有研究報(bào)道中，主要限于單味中藥對(duì)胸腺Caspase-3蛋白的影響。周金星等[15]對(duì)炒白術(shù)、山楂、黃芪、板藍(lán)根、茯苓、陳皮、甘草、山藥等中藥材按一定比例制成復(fù)方中藥制劑，研究表明，其合理劑量可顯著提高SD大鼠血清T-AOC、T-SOD、GSH-Px活性和降低MDA含量的抗氧化功能，但該復(fù)方中藥制劑對(duì)SD大鼠胸腺組織結(jié)構(gòu)及其Caspase-3蛋白在大鼠胸腺中的分布未有報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)擬探究由上述8種中藥制成的復(fù)方中藥制劑對(duì)SD大鼠胸腺組織結(jié)構(gòu)和Caspase-3蛋白的影響，為其復(fù)方中藥制劑的開(kāi)發(fā)利用提供研究資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用健康、體質(zhì)量相似的斷奶(25±2)d SD大鼠60只，全部為雄性，SPF級(jí)，購(gòu)買于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)：SCXK皖2011-002)。所有大鼠均飼養(yǎng)在SPF級(jí)環(huán)境中的全膜終端過(guò)濾式獨(dú)立送風(fēng)IVC籠具中，溫度和濕度分別控制在24～28 ℃及50%～60%濕度，每天光照12 h。

1.2 復(fù)方中藥制劑配制

實(shí)驗(yàn)用復(fù)方中藥制劑由炒白術(shù)、山楂、黃芪、板藍(lán)根、茯苓、陳皮、甘草、山藥等按不同配比制成。組方配比后，分別添加復(fù)方中草藥質(zhì)量4倍的蒸餾水浸泡24 h，經(jīng)水煮醇沉，濃縮后制成每mL水煎醇沉液相當(dāng)于1 g生藥材的復(fù)方中藥制劑，備用。經(jīng)青島科標(biāo)檢測(cè)研究院對(duì)制備好的復(fù)方中藥制劑檢測(cè)鑒定，其主要成分含量為甘草苷82.44 mg·L-1，總多糖6.12 g·L-1，白術(shù)內(nèi)酯3.67 mg·L-1，總黃酮0.047 g·L-1，總皂苷0.448 g·L-1。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)用SD大鼠60只，隨機(jī)分成對(duì)照組、復(fù)方中藥制劑1.5 mL·kg-1組、3.0 mL·kg-1組和6.0 mL·kg-1組，每組15只，預(yù)飼1 周后根據(jù)SD大鼠體質(zhì)量每天分別灌胃1.5、3.0和6.0 mL·kg-1復(fù)方中藥制劑，灌胃前3 h禁水禁食，定時(shí)稱量，對(duì)照組按體質(zhì)量同時(shí)灌胃蒸餾水3.0 mL·kg-1。

1.4 胸腺樣品的采集與處理

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第90 天，各處理組SD大鼠禁食禁水3 h后，稱量、麻醉、取完整胸腺組織稱量后立即分割成小塊投入到4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定72 h，經(jīng)流水沖洗24 h，梯度酒精脫水，醇苯、二甲苯透明，浸蠟、包埋、切片、水浴鍋展片、粘片、烤片后備用。

1.5 胸腺生長(zhǎng)指數(shù)測(cè)定

胸腺生長(zhǎng)指數(shù)為胸腺質(zhì)量與大鼠體質(zhì)量的比值。

1.6 組織切片染色

1.6.1 常規(guī)HE染色

將制作好的組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精清洗，蘇木精與伊紅染色后脫水、透明并封片，ZEISS正置熒光顯微鏡下觀察不同實(shí)驗(yàn)組SD大鼠胸腺基本組織結(jié)構(gòu)并攝影。

1.6.2 網(wǎng)狀纖維染色

組織切片常規(guī)脫蠟至水，0.5%高錳酸鉀染5 min，蒸餾水洗，2%草酸1 min，蒸餾水洗干凈，2%鐵明礬水溶液10 min，蒸餾水洗，放入銀氨工作液作用15 min，10%福爾馬林(中性)10 min，蒸餾水洗，5%硫代硫酸鈉3 min，80%酒精、95%Ⅰ酒精清洗，95%Ⅱ、100%酒精Ⅰ、Ⅱ脫水各5 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明10 min，封片。ZEISS正置熒光顯微鏡觀察各組大鼠胸腺中網(wǎng)狀纖維分布并攝影。

1.6.3 免疫組織化學(xué)染色

切片常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水、PBS先后浸泡5 min，浸泡于0.01 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液中，經(jīng)微波爐高火加熱煮沸后改用中火，并維持10～15 min，室溫下自然冷卻，PBS清洗3次。然后滴加3% H2O2阻斷，PBS清洗3次。滴加封閉液，作用10～15 min，擦去封閉液，滴加一抗，在37 ℃濕盒中孵育2～3 h，PBS清洗。滴加二抗，37 ℃孵育15 min，PBS清洗3次后滴加三抗，37 ℃作用10～15 min，PBS清洗，DAB顯色。蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化，流水沖洗返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。ZEISS正置熒光顯微鏡下觀察SD大鼠胸腺中Caspase-3蛋白分布并攝影。

1.7 圖片分析及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

各實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選擇胸腺髓質(zhì)部10個(gè)視野，利用Image-pro PLUS 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞，并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞面積百分比。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因子方差分析法(one-way ANOVA)進(jìn)行比較，以P值小于0.05作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方中藥制劑對(duì)SD大鼠胸腺生長(zhǎng)指數(shù)的影響

由圖1可見(jiàn)，灌胃復(fù)方中藥制劑90 d后，3.0 mL·kg-1組SD大鼠胸腺生長(zhǎng)指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，1.5 mL·kg-1組和6.0 mL·kg-1組SD大鼠胸腺生長(zhǎng)指數(shù)雖高于對(duì)照組，但與對(duì)照組比較差異不顯著。

*表示組間差異顯著(P<0.05)；**表示組間差異極顯著(P<0.01)。下同。* indicated the significant difference between groups (P<0.05); ** indicated the extremely significant difference between groups (P<0.01); The same as below.圖1 復(fù)方中藥制劑對(duì)SD大鼠胸腺生長(zhǎng)指數(shù)的影響Fig.1 Effect of compound Chinese medicine preparation on the thymus growth index of SD rats

2.2 復(fù)方中藥制劑對(duì)SD大鼠胸腺基本組織結(jié)構(gòu)的影響

通過(guò)HE染色觀察SD大鼠胸腺基本組織結(jié)構(gòu)可見(jiàn)，與對(duì)照組(圖2-A)比較，灌胃復(fù)方中藥制劑1.5 mL·kg-1和3.0 mL·kg-1組胸腺皮質(zhì)區(qū)顯著增加(圖2-B，2-C)，髓質(zhì)區(qū)較對(duì)照組變小，但灌胃復(fù)方中藥制劑6.0 mL·kg-1組(圖2-D)胸腺皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)區(qū)與對(duì)照組比較變化不顯著。

2.3 復(fù)方中藥制劑對(duì)SD大鼠胸腺網(wǎng)狀纖維的影響

通過(guò)Grimelius染色觀察SD大鼠胸腺組織結(jié)構(gòu)可見(jiàn)，SD大鼠胸腺網(wǎng)狀纖維分布于胸腺髓質(zhì)且交錯(cuò)成網(wǎng)狀，皮質(zhì)部的淋巴細(xì)胞功能區(qū)無(wú)網(wǎng)狀纖維。與對(duì)照組(圖3-A)比較，各實(shí)驗(yàn)組SD大鼠胸腺髓質(zhì)部網(wǎng)狀纖維含量均少于對(duì)照組，其中灌胃復(fù)方中藥制劑3.0 mL·kg-1實(shí)驗(yàn)組(圖3-C)髓質(zhì)部網(wǎng)狀纖維與對(duì)照組比較極顯著減少，灌胃復(fù)方中藥制劑1.5 mL·kg-1實(shí)驗(yàn)組(圖3-B)與對(duì)照組比較髓質(zhì)部網(wǎng)狀纖維變化不顯著，6.0 mL·kg-1實(shí)驗(yàn)組(圖3-D)髓質(zhì)部網(wǎng)狀纖維略少于對(duì)照組。

2.4 復(fù)方中藥制劑對(duì)SD大鼠胸腺Caspase-3蛋白分布的影響

通過(guò)Caspase-3免疫組織化學(xué)染色觀察可見(jiàn)，SD大鼠胸腺中Caspase-3蛋白主要分布于胸腺的髓質(zhì)部。與對(duì)照組(圖4-A)比較，灌胃復(fù)方中藥制劑3.0 mL·kg-1實(shí)驗(yàn)組(圖4-C)Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少，但灌胃復(fù)方中藥制劑1.5 mL·kg-1實(shí)驗(yàn)組(圖4-B)與對(duì)照組比較差異不顯著，灌胃復(fù)方中藥制劑6.0 mL·kg-1實(shí)驗(yàn)組(圖4-D)與對(duì)照組比較陽(yáng)性細(xì)胞減少。通過(guò)Image-pro PLUS 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞面積百分比可見(jiàn)，復(fù)方中藥制劑3.0 mL·kg-1實(shí)驗(yàn)組Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞面積顯著少于對(duì)照組(P<0.05)，1.5 mL·kg-1和6.0 mL·kg-1實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照減少，但差異不顯著(圖5)。

A，對(duì)照組SD大鼠胸腺網(wǎng)狀纖維；B，1.5 mL·kg-1組SD大鼠胸腺網(wǎng)狀纖維；C，3.0 mL·kg-1組SD大鼠胸腺網(wǎng)狀纖維；D，6.0 mL·kg-1組SD大鼠胸腺網(wǎng)狀纖維；箭頭表示網(wǎng)狀纖維；Grimelius染色；標(biāo)尺示20 μm。A，The reticular fiber of control thymus of SD rats; B，The reticular fiber of 1.5 mL·kg-1 thymus of SD rats; C，The reticular fiber of 3.0 mL·kg-1 thymus of SD rats; D，The reticular fiber of 6.0 mL·kg-1 thymus of SD rats; The arrow shows reticular fiber; Grimelius dyeing; Bar，20 μm.圖3 復(fù)方中藥制劑對(duì)SD大鼠胸腺網(wǎng)狀纖維的影響Fig.3 Effect of compound Chinese medicine preparation on the thymus reticular fiber of SD rats

A，對(duì)照組SD大鼠胸腺Caspase-3蛋白分布；B，1.5 mL·kg-1組SD大鼠Caspase-3d蛋白分布；C，3.0 mL·kg-1組SD大鼠胸腺Caspase-3蛋白分布；D，6.0 mL·kg-1組SD大鼠胸腺Caspase-3蛋白分布；箭頭表示Caspase-3蛋白陽(yáng)性細(xì)胞；Caspase-3蛋白免疫組化染色；標(biāo)尺示20 μm。A，The caspase-3 protein of control thymus of SD rats; B，The caspase-3 protein of 1.5 mL·kg-1 thymus of SD rats; C，The caspase-3 protein of 3.0 mL·kg-1 thymus of SD rats; D，The caspase-3 protein of 6.0 mL·kg-1 thymus of SD rats; The arrow shows caspase-3 protein positive cells; Caspase-3 protein immunohistochemical dyeing; Bar，20 μm.圖4 復(fù)方中藥制劑對(duì)SD大鼠胸腺Caspase-3蛋白的影響Fig.4 Effect of compound Chinese medicine preparation on the caspase-3 protein of SD rats

圖5 復(fù)方中藥制劑對(duì)SD大鼠胸腺Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞面積比的影響Fig.5 Effect of compound Chinese medicine preparation on the area of Caspase-3 positive cells of SD rats

3 討論

3.1 復(fù)方中藥制劑影響SD大鼠胸腺組織結(jié)構(gòu)

胸腺是動(dòng)物機(jī)體重要的中樞免疫器官，主要功能是培育T淋巴細(xì)胞，并分泌胸腺素和胸腺生長(zhǎng)素，隨著動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和日齡的增加，其功能會(huì)逐漸退化。因此，胸腺的生長(zhǎng)指數(shù)和組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)反映了胸腺的生長(zhǎng)發(fā)育和功能狀態(tài)，胸腺指數(shù)的高低同時(shí)也反映機(jī)體免疫功能的高低[16]。本研究結(jié)果表明，由炒白術(shù)、山楂、黃芪、板藍(lán)根、茯苓、陳皮、甘草、山藥等中藥材按一定比例配制成復(fù)方中藥制劑，其按體質(zhì)量1.5、3.0和6.0 mL·kg-1灌胃SD大鼠90 d后，其胸腺指數(shù)較對(duì)照組都會(huì)提高，其中3.0 mL·kg-1組顯著增加。通過(guò)組織結(jié)構(gòu)觀察可見(jiàn)，灌胃3.0 mL·kg-1劑量的復(fù)方中藥制劑，其胸腺皮質(zhì)部面積較對(duì)照組顯著增加。由于胸腺皮質(zhì)部主要含T淋巴細(xì)胞，因此，隨著胸腺皮質(zhì)部面積增加，T淋巴細(xì)胞在胸腺細(xì)胞中所占的比例相對(duì)增加，從組織學(xué)的角度證明SD大鼠按體質(zhì)量灌胃3.0·kg-1復(fù)方中藥制劑可改善胸腺的組織結(jié)構(gòu)，延緩SD大鼠胸腺退化時(shí)間，從而增強(qiáng)胸腺的免疫功能。本復(fù)方中藥制劑藥液經(jīng)青島科標(biāo)檢測(cè)研究院檢測(cè)分析，其總多糖成分高達(dá)6.12 g·L-1，研究表明，許多中藥成分可提高胸腺的生長(zhǎng)指數(shù)，拮抗衰老胸腺的功能[4-7，9-10]，所以，按體質(zhì)量灌胃3.0 mL·kg-1復(fù)方中藥制劑提高SD大鼠胸腺的組織結(jié)構(gòu)和功能，其藥液中含量較高多糖成分可能起到重要作用，但與復(fù)方中藥制劑的用量不呈正相關(guān)。

網(wǎng)狀纖維和膠原纖維、彈性纖維一樣，屬于結(jié)締組織內(nèi)的一種纖維類型，主要由網(wǎng)狀細(xì)胞形成[17]。網(wǎng)狀纖維穿梭于網(wǎng)狀細(xì)胞的胞體和突起之間，與網(wǎng)狀細(xì)胞共同形成支架，器官組織中網(wǎng)狀纖維的分布狀態(tài)和數(shù)量可以為器官的功能狀態(tài)及病理變化提供重要參考，因此具有重要的意義[18]。本研究結(jié)果表明，SD大鼠胸腺網(wǎng)狀纖維主要分布于胸腺髓質(zhì)部，胸腺皮質(zhì)少見(jiàn)或未見(jiàn)網(wǎng)狀纖維。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較可見(jiàn)，髓質(zhì)部網(wǎng)狀纖維含量少于對(duì)照組，其中3.0 mL·kg-1組最顯著，1.5 mL·kg-1和6.0 mL·kg-1組與對(duì)照組比較無(wú)顯著變化。由于網(wǎng)狀纖維的減少，可以減輕或避免胸腺組織的纖維化，對(duì)其正常功能行使和發(fā)揮具有重要意義。3.0 mL·kg-1復(fù)方中藥制劑可顯著減少網(wǎng)狀纖維，從而可能在提高胸腺免疫功能上具有一定的參考意義。

3.2 復(fù)方中藥制劑影響SD大鼠胸腺組織中Caspase-3蛋白的分布

Caspase-3蛋白是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的重要蛋白，胸腺是中樞免疫器官，其重要特點(diǎn)是隨著年齡的增加其結(jié)構(gòu)和功能都逐漸退化，研究表明，中藥多糖可抑制胸腺中Caspase-3的表達(dá)，如黃芪注射液可以下調(diào)胸腺中Caspase-3表達(dá)來(lái)抑制胸腺T淋巴細(xì)胞的凋亡，從而保護(hù)胸腺的萎縮，增強(qiáng)胸腺的功能[14]。五味子多糖能夠抑制環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠胸腺細(xì)胞的凋亡，降低胸腺細(xì)胞的損傷[19]。本研究中，復(fù)方中藥制劑選用“扶正固本、清熱解毒”類中藥炒白術(shù)、山楂、黃芪、板藍(lán)根、茯苓、陳皮、甘草、山藥組成，結(jié)果表明，復(fù)方中藥制劑3.0 mL·kg-1實(shí)驗(yàn)組Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞面積顯著少于對(duì)照組，說(shuō)明在灌胃藥液后，按體質(zhì)量灌胃3.0 mL·kg-1劑量的藥液可以抑制SD大鼠胸腺中Caspase-3蛋白的出現(xiàn)，從而對(duì)延緩胸腺的結(jié)構(gòu)萎縮和功能退化有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，由炒白術(shù)、山楂、黃芪、板藍(lán)根、茯苓、陳皮、甘草、山藥等按一定比例配制的復(fù)方中藥制劑對(duì)改善SD大鼠胸腺的組織結(jié)構(gòu)，提高胸腺生長(zhǎng)指數(shù)，減少胸腺中網(wǎng)狀纖維的分布數(shù)量和抑制Caspase-3蛋白出現(xiàn)有較好的效果，其中以3.0 mL·kg-1劑量組最為顯著。

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