張 揚(yáng)，姚文成，王 彬，盧立志，王兆山，徐 琪，常國(guó)斌，陳國(guó)宏，*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021； 3.江蘇益客食品有限公司，江蘇 宿遷 223800)

據(jù)《事物紺珠》記載，400年前明代飼養(yǎng)有“頂有高毛、白毛、烏骨”的鳳頭白羽鴨[1]。本課題組經(jīng)過選育，培育出3 000只具有典型鳳頭性狀的鳳頭白鴨(暫定名)群體[2]。該群體鴨頭部后方的皮膚有一突出的隆起，具有鮮明的觀賞特征，可作為動(dòng)物園、水景濕地公園等觀賞品種[3]。雖然鳳頭性狀現(xiàn)已得到一定的利用，但其遺傳規(guī)律、形成原因以及調(diào)控機(jī)制尚未闡明。本研究選取了可能與鳳頭白鴨鳳頭性狀相關(guān)的基因作為候選因果基因，對(duì)這些基因在2種鴨內(nèi)臟和皮膚等組織中的表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比分析，尋找其差異，以期為揭示鴨鳳頭表型的產(chǎn)生和尋找其致因突變位點(diǎn)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取10周齡鳳頭白鴨、連城白鴨各4只，頸部放血后采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腦、小腦、背部皮膚、頭部皮膚、鳳頭下皮膚、鳳頭顱內(nèi)脂肪體等組織樣品，貯存在-70 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI網(wǎng)站GenBank收集的鴨Hoxc8、EphA2、EphA3、EphB2、GAPDH基因序列，利用Primer Blast設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程公司(上海)進(jìn)行合成。引物序列見表1。

1.3 基因的PCR擴(kuò)增

采用Trizol研磨法提取2個(gè)群體共計(jì)8個(gè)樣品的總RNA，自然干燥后溶于甲酰胺中，-70 ℃保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄體系如下：1 μg總RNA樣品，1 μL隨機(jī)引物，4 μL 25 mmol·L-1MgCl2，2 μL 10×RT緩沖液，2 μL dNTP，0.5 μL RNA酶抑制劑，1 μL反轉(zhuǎn)錄酶，加入RNase-free H2O至20 μL。反轉(zhuǎn)錄程序參照北京天根生物科技有限公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行，42 ℃孵育15 min后立即95 ℃孵育5 min，獲得的cDNA -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

使用特異性引物，以cDNA為模板，利用PCR進(jìn)行擴(kuò)增。各組織候選基因及內(nèi)參基因重復(fù)擴(kuò)增3次，采用2-△△ct法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表1 相關(guān)基因擴(kuò)增引物Table 1 Primers for related genes

2 結(jié)果與分析

2.1 Hoxc8基因的組織表達(dá)分析

Hoxc8基因在2種鴨心臟(X)、肝臟(G)、脾臟(P)、肺臟(F)、腎臟(S)、大腦(DN)、小腦(XN)、背部皮膚(BP)、頭部皮膚(TP)、鳳頭下皮膚(FP)、顱內(nèi)脂肪體(ZF)中的表達(dá)情況見圖1。研究發(fā)現(xiàn)，Hoxc8 2種鴨在大腦、小腦和腎臟組織中有少量表達(dá)，并且在背部皮膚組織中表達(dá)最高，顯著高于其他組織(P<0.05)。Hoxc8在鳳頭白鴨特有組織(鳳頭下皮膚、顱內(nèi)脂肪體)中呈現(xiàn)為異常高表達(dá)，在連城白鴨頭部皮膚(鳳頭鴨鳳頭下皮膚對(duì)應(yīng)部位)中表達(dá)量極低。

**表示不同品種間差異顯著(P<0.01)。**indicated significant difference for that indicator at P<0.01.圖1 Hoxc8、EphA2、EphA3、EphB2基因的相對(duì)組織表達(dá)Fig.1 Relative expression of Hoxc8，EphB2，EphA2，EphA3 genes in tissues

2.2 Eph基因家族的組織表達(dá)分析

EphB2、EphA2、EphA3在2種鴨各組織的相對(duì)表達(dá)見圖1。由圖可見，EphB2在2種鴨各組織中存在明顯的表達(dá)差異性。其中，在2種鴨都采集的組織中，大腦和小腦組織中EphB2的表達(dá)量最高；同時(shí)，EphB2在顱內(nèi)脂肪體組織(鳳頭白鴨特有)中，表現(xiàn)為異常的高表達(dá)。EphA2在2種鴨的各組織中也均表現(xiàn)為不同程度的表達(dá)。其中，在肺、背部皮膚、頭部皮膚等組織中表達(dá)較高。與EphB2類似，EphA2在顱內(nèi)脂肪體組織中，表現(xiàn)為異常的高表達(dá)。而在相鄰的大腦和小腦組織中，EphA2表現(xiàn)出低表達(dá)。EphA3在2種鴨的各組織中表現(xiàn)為明顯的異位表達(dá)規(guī)律，其中，EphA3在肺、大腦、小腦等共有的組織中表達(dá)較高，在大腦表達(dá)最高，顯著高于其他組織。EphA3與EphB2、EphA2一樣在顱內(nèi)脂肪體組織中呈現(xiàn)出異常的高表達(dá)。

3 討論

前人通過GWAS分析的方法[4]，將雞鳳頭性狀決定基因定位在Hox連鎖群上，隨后Wang等[5]進(jìn)一步的證實(shí)Hoxc8是Hox連鎖群上唯一一個(gè)和雞鳳頭性狀直接相關(guān)的基因。雞的Hoxc8基因在各個(gè)組織均明顯的表現(xiàn)為異位表達(dá)，其中腎臟組織和背部皮膚的表達(dá)量顯著高于其他組織，并且在鳳頭下皮膚組織中呈中高度表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，Hoxc8基因表現(xiàn)為組織特異性表達(dá)，并且在鳳頭鴨背部皮膚、鳳頭下皮膚中高表達(dá)，驗(yàn)證了將Hoxc8作為鳳頭性狀因果候選基因的可能。早期研究發(fā)現(xiàn)，鴨鳳頭性狀的遺傳規(guī)律不符合孟德爾顯性和隱形性狀遺傳規(guī)律，而更可能像受到多基因控制的一個(gè)數(shù)量性狀。在鳳頭白鴨特有組織顱內(nèi)脂肪體中，Hoxc8基因的高表達(dá)顯示，鳳頭的頂心毛表觀性狀和顱內(nèi)脂肪體的發(fā)生可能存在一定的連鎖性。

Eph作為受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)家族的一個(gè)最大的分支，現(xiàn)已知它包含16個(gè)成員，其配體命名為Ephrin[6]。根據(jù)配體結(jié)構(gòu)及相結(jié)合能力，可將Eph受體分成A(10個(gè))、B(6個(gè))亞家族：EphA(EphA1-EphA10)和EphB(EphB1-EphB6)。已有研究表明，在動(dòng)物神經(jīng)發(fā)育的軸突導(dǎo)向中，Eph發(fā)揮了重要作用，并且在組織和細(xì)胞之間調(diào)控信息的傳遞。在神經(jīng)系統(tǒng)之外，如在免疫系統(tǒng)、骨骼、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中，Eph和Ephrin也發(fā)揮了相關(guān)作用[7]，其中在腦腫瘤中，大量研究證實(shí)EphA2、EphA3、EphB2、EphB4及其它們相應(yīng)的配體均表現(xiàn)為高表達(dá)[8-9]。

相對(duì)于2種鴨的共有組織，在鳳頭白鴨特有組織顱內(nèi)脂肪體中，3個(gè)候選基因(EphA2、EphA3、EphB2)均表現(xiàn)為較高的相對(duì)表達(dá)量，與該家族基因在鴿皮膚組織表達(dá)較為相似[10]，這說明EphB2、EphA2、EphA3等Eph基因可能與鳳頭白鴨顱內(nèi)脂肪的形成有關(guān)。這3個(gè)基因中，尤其是EphA2在顱內(nèi)脂肪體的表達(dá)量相對(duì)于臨近的組織大腦、小腦表達(dá)量很高，這說明EphA2極有可能和鴿上的機(jī)制相似，與鴨鳳頭性狀的形成有密切的聯(lián)系。90%的鳳頭白鴨個(gè)體的顱內(nèi)都存在脂肪體，并且有極少數(shù)個(gè)體表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)共濟(jì)失調(diào)，可能由于顱內(nèi)脂肪體組織的生成使得小腦、嗅球等組織被擠壓而體積較小[11]，不能正常生長(zhǎng)和發(fā)育，對(duì)機(jī)體的運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生了影響。

鴨鳳頭性狀如此特殊并且是可遺傳的，但其致因突變位點(diǎn)還未被準(zhǔn)確定位，本研究分析了與鳳頭性狀形成相關(guān)的4個(gè)候選基因的組織表達(dá)，為尋找鴨鳳頭性狀的形成機(jī)制提供了數(shù)據(jù)參考。

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