仙 靚，金 明，馬艷茹，張新新，郭增軍

(西安交通大學藥學院，西安 710061)

藥材捆仙七是“陜西七藥”中重要的品種，分布在我國陜西、甘肅、四川、湖北、浙江等省及日本等地[1-6]。據(jù)《中華本草》記載，該藥材具有清熱解毒、祛風除濕、舒筋活絡、消炎止痛和活血止帶等作用，在民間應用廣泛[7-9]。一般以全草入藥，味苦微辛，可作為復方藥治療老年慢性支氣管炎和風濕性關節(jié)炎等疾病[10-14]。目前，國內(nèi)外學者對捆仙七的生物堿成分進行了大量研究，發(fā)現(xiàn)捆仙七中含有大量孕甾烷型生物堿[15]，但對其非生物堿成分的研究相對較少。本文用Semi-preparative HPLC法對捆仙七非生物堿部分進行分離并采用NMR等波譜學方法進行結構鑒定。

1 儀器與試藥

1.1儀器 TM-010超聲波清洗機(無錫臺銘環(huán)?？萍加邢薰?；RE-52A旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；XPE105電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；UV-1800紫外可見分光光度計(日本島津公司)；New Style制備高效液相色譜儀(含N7000二元泵、NV3000 serials紫外雙波長檢測器、2 mL定量環(huán)和Easy Chrom色譜工作站，江蘇漢邦科技有限公司)；Megres C18色譜柱(10 mm×250 mm，5 μm)；Bruker AM-400 MHz核磁共振光譜儀(美國Bruker公司)。

1.2試藥 捆仙七藥材采自西安交通大學醫(yī)學部藥學院藥圃，經(jīng)西安交通大學醫(yī)學部藥學院天然藥物化學實驗室鑒定為黃楊科(Buxacea)板凳果屬(Pachysandra)植物頂花板凳果(PachysandraterminalisSieb.et Zucc.)的干燥全草。乙醇，工業(yè)純(西安化學試劑廠)；石油醚、乙酸乙酯和正丁醇均為分析純(天津大茂化學試劑廠)；鹽酸，分析純(武漢市鑫華松化工有限公司)；氘代二甲基亞砜、氘代氯仿和氘代甲醇(美國Fisher公司)；甲醇，色譜純(天津科密歐化學試劑廠)；水為自制雙蒸水；柱層析硅膠和薄層色譜硅膠均為分析純(青島海浪硅膠干燥劑有限公司)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1捆仙七非生物堿部位的制備與分離 將7.5 kg捆仙七藥材粗粉用10倍量乙醇回流提取3次，每次2 h，回收溶劑，得到1.5 kg乙醇提取物浸膏。取浸膏1.0 kg，用10倍量20 mL·L-1的鹽酸進行溶解，過濾，得濾渣(即捆仙七非生物堿部位粗提物)。將上述濾渣用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇等不同極性溶劑萃取，將萃取液減壓濃縮后得到石油醚部位(25.3 g)、乙酸乙酯部位(36.2 g)和正丁醇部位(102.3 g)提取物。

取30 g捆仙七乙酸乙酯部位浸膏，用硅膠柱進行分離，流動相為石油醚-乙酸乙酯(100∶1～1∶10)，收集洗脫液并合并，減壓蒸干溶劑，得到Frac.A1～A10餾分。

將Frac.A5用硅膠柱進行分離，流動相為石油醚-乙酸乙酯(50∶1～1∶5)，收集洗脫液并合并，得到Frac.A5-3及Frac.A5-4餾分。將Frac.A6用硅膠柱進行分離，流動相為石油醚-乙酸乙酯(30∶1～1∶5)，收集洗脫液并合并，得到Frac.A6-6及Frac.A6-11餾分。

2.2Semi-preparative HPLC分離純化

2.2.1Frac.A5-3餾分分離 將Frac.A5-3用色譜甲醇溶解，0.45 μm濾膜過濾，備用。用Semi-preparative HPLC法進行分離。色譜條件：流動相：甲醇-水(53∶47)；柱溫：室溫；紫外檢測波長：345 nm。將色譜圖中的主峰收集，回收溶劑，得單體化合物1。見圖1。

圖1化合物1Semi-preparativeHPLC圖

Fig.1 The Semi-preparative HPLC chromatogram of compound1

2.2.2Frac.A5-4餾分分離 將Frac.A5-4用色譜甲醇溶解，0.45 μm濾膜過濾，備用。Semi-preparative HPLC進行分離。色譜條件：流動相：甲醇-水(30∶70)洗脫；柱溫：室溫；紫外檢測波長：250 nm。將色譜圖中的主峰收集，回收溶劑，得單體化合物2和3。見圖2。

圖2化合物2～3Semi-preparativeHPLC圖

Fig.2 The Semi-preparative HPLC chromatogram of compounds2-3

2.2.3Frac.A6-6餾分分離 將Frac.A6-6用色譜甲醇溶解，0.45 μm濾膜過濾，備用。用Semi-preparative HPLC進行分離。色譜條件：流動相：甲醇-水(20∶80)梯度洗脫；柱溫：室溫；紫外檢測波長：261 nm。將色譜圖中的主峰收集，回收溶劑，得單體化合物4。見圖3。

圖3化合物4Semi-preparativeHPLC圖

Fig.3 The Semi-preparative HPLC chromatogram of compound4

2.2.4Frac.A6-11餾分分離 將Frac.A6-11用色譜甲醇溶解，0.45 μm濾膜過濾，備用。Semi-preparative HPLC進行分離。色譜條件：流動相：甲醇-水(60∶40)梯度洗；柱溫：室溫；紫外檢測波長：250 nm。將色譜圖中的主峰收集，回收溶劑，得單體化合物5。見圖4。

圖4化合物5Semi-preparativeHPLC圖

Fig.4 The Semi-preparative HPLC chromatogram of compound5

2.3化合物的結構鑒定

2.3.1化合物11H-NMR(400 MHz，DMSO)δppm：10.33 (s，1H)，7.92 (d，J=9.4 Hz，1H)，7.23 (s，1H)，6.79 (s，1H)，6.23 (d，J=9.4 Hz，1H)，3.82 (s，3H)。13C-NMR(100 MHz，DMSO)δppm：56.30 (-OCH3)，103.05(C-8)，109.87(C-5)，110.86 (C-10)，112.02 (C-3)，144.80(C-4)，145.52 (C-6)，149.80 (C-9)，151.39(C-7)，160.99(C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道的東莨菪亭一致，故鑒定化合物1為東莨菪亭(scopoletin)。

2.3.2化合物21H-NMR (400 MHz，DMSO)δppm：7.61 (1H，d，J=9.5 Hz，H-4)，6.28 (1H，d，J=9.5 Hz，H-3)，6.66 (1H，s，H-5)，4.09 (3H，s，8-OCH3)，3.94 (3H，s，6-OCH3)。13C-NMR(100 MHz，DMSO)δppm：160.7(C-2)，113.5(C-3)，143.9(C-4)，103.2(C-5)，144.6 (C-6)，142.4(C-7)，134.54(C-8)，143.1(C-9)，111.2(C-10)，61.7(8-OCH3)，56.58(6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道的異秦皮定一致，故鑒定化合物2為異秦皮定(isofraxidin)。

2.3.3化合物31H-NMR(400 MHz，CDCl3)δppm：3.11(2H，m，H-1，5)，4.74 (2H，d，J=4.3 Hz，H-2，6)，4.25 (2H，dd，J=9.1，6.9 Hz，H-4eq，8eq)，6.82～6.90 (6H，m，aromatic protons)，3.91 (6H，s，-OCH3)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δppm：54.2(C-1，5)，85.9(C-2，6)，71.7(C-4)，132.9(C-1′，1″)，108.6(C-2′，2″)，146.7(C-3′，3″)，145.2(C-4′，4″)，114.3(C-5′，5″)，118.9 (C-6′，6″)，55.9 (2-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道的松脂醇一致，故鑒定化合物3為松脂醇(pinoresinol)。

2.3.4化合物41H-NMR(400 MHz，MeOD)δppm：7.44 (1H，d，J=1.6 Hz，H-2)，7.42(1H，J=6.0 Hz，H-5)，6.80(1H，dd，J=6.0，1.6 Hz，H-6)。13C-NMR(100 MHz，MeOD)δppm:121.85(C-1)，114.36(C-2)，144.65(C-3)，150.10(C-4)，116.33(C-5)，122.51(C-6)，168.98(-COOH)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道的原兒茶酸一致，故鑒定化合物4為原兒茶酸(protocatechuic acid)。

2.3.5化合物51H-NMR(400 MHz，MeOD)δppm：6.18 (1H，d，J=2.3 Hz，H-6)，6.38 (1H，d，J=2.3 Hz，H-8)，6.88 (1H，d，J=8.2 Hz，H-5′)，7.63 (1H，dd，J=8.2，2.3 Hz，H=6′)，7.74 (1H，d，J=1.7 Hz，H-2′)。13C-NMR(400 MHz，MeOD)δppm:146.6(C-2)，135.9(C-3)，175.9(C-4)，161.1(C-5)，97.9(C-6)，164.4(C-7)，93.0(C-8)，156.8(C-9)，103.1(C-10)，120.3(C-1′)，114.6(C-2′)，144.8(C-3′)，114.8 (C-5′)，122.7(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]報道的槲皮素一致，故鑒定化合物5為槲皮素(quercetin)。

3 討論

3.1樣品前處理 為了增加建立Semi-preparative HPLC法的重復性及穩(wěn)定性，同時保證從捆仙七中分離得到高純度的化合物以滿足結構解析的要求，在經(jīng)Semi-preparative HPLC進一步分離純化前，樣品中對待分離化合物的干擾雜質成分要盡可能少。因此，乙酸乙酯非生物堿部位要經(jīng)過多次常壓硅膠色譜柱層析，所得不同極性的餾分在薄層色譜上視檢時，僅能觀察到2到3個主斑點，或常壓硅膠色譜柱不能將成分再次分離。

3.2優(yōu)化制備色譜條件

3.2.1選擇溶解樣品的溶劑 本實驗比較了甲醇、乙腈、甲醇-水和乙腈-水對樣品的溶解情況，結果表明，樣品在甲醇中的溶解度較大。為了降低進樣體積和避免色譜峰展寬同時提高分離目標化合物的純度，本實驗最終選擇甲醇作為溶解樣品的溶劑。

3.2.2流動相的選擇 為了使分離目標化合物與鄰近雜質達到基線分離，實驗過程中比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水(含5 mL·L-1冰醋酸)和乙腈-水(含5 mL·L-1冰醋酸)等溶劑系統(tǒng)。結果表明，捆仙七中的非生物堿成分在甲醇-水系統(tǒng)中具有較好的分離度，且峰形良好，出峰時間較短，因此，本實驗最終選擇甲醇-水作為從捆仙七中分離非生物堿成分的流動相。

3.2.3優(yōu)選其他條件 在確定了流動相組成后，為了提高效率和保證所分離目標成分的純度，實驗過程中還對其他色譜條件進行了優(yōu)化，如流速、洗脫模式和進樣量。由于本實驗所用的Megres C18直徑為10 mm，根據(jù)Van Deemter方程得出其最佳流速為4 mL·min-1。本實驗采用紫外檢測器對分離化合物進行檢測，為了避免基線漂移影響化合物峰形辨識，最終選用等度洗脫模式。不同樣品所含雜質復雜程度不同，在滿足目標化合物與鄰近雜質滿足基線分離的前提條件下，進樣量可一直增加。

3.3檢測波長的確定 由于前期缺少對捆仙七非生物堿成分結構屬性的信息，本實驗首先用紫外分光光度計在200～400 nm范圍內(nèi)對分離樣品進行全波長掃描，確定最佳檢測波長，便于目標成分在Semi-preparative HPLC紫外檢測器上檢出。

參考文獻：

[1] 郭增軍，卜筱茜，王軍憲，等.陜西“七藥”植物資源及研究概要[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志，2006，(79):79-81.

[2] 席可，郭增軍，張卉，等.陜西七藥中的一藥多源考證及分析[J].西北藥學雜志，2013，28(6)：565-569.

[3] 李夢怡，張卉，韓玲，等.捆仙七石油醚部分的GC-MS分析[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2014，28(1)：40-42.

[4] 馬祥瑞，焦麗華，朱永強.頂花板凳果特性及繁育應用[J].林業(yè)科學，2016，(31):129.

[5] 王世軍.頂花板凳果甾體生物堿的提取和次生代謝物的檢測[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2014:1-8.

[6] 張祥，崔衛(wèi)軍，周玲，等.陜西太白山國家自然保護區(qū)“太白七藥”種質資源及其分布[J].陜西林業(yè)科技，2012，(3):7-13.

[7] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M].上海:上?？茖W技術出版社，1998：222-224.

[8] 韓玲，郭增軍，吳楠，等.十種陜西“七藥”的紅外光譜法鑒別研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2011，25(6):32-34.

[9] 韓玲，郭增軍，吳楠，等.10種陜西七藥的紫外譜線組研究[J].陜西中醫(yī)，2011，32(4):483-484,486.

[10]郭增軍.陜西七藥[M].西安:陜西科學技術出版社，2003:259-261.

[11]吳振海，傅青，陳書文.陜西民間“七”藥種類整理[J].中藥材，1990，13(5)：14-16.

[12]李萍，任紅莉.陜西地產(chǎn)“七”藥[J]．世界最新醫(yī)學信息文摘，2003，2(3)：681-686.

[13]李晨陽.轉筋草中極性化學成分及生物活性研究[D]．天津：天津醫(yī)科大學，2010:51-65.

[14]趙川.轉筋草生物堿成分及抗腫瘤轉移活性研究[D]．天津：天津醫(yī)科大學，2013:77-98.

[15]仙靚，李夢怡，薛璇璣，等.頂花板凳果化學成分及藥理活性研究進展[J]．西北藥學雜志，2017，32(4):534-538．

[16]Wu Q，Zou L，Yang X W，et al.Novel sesquiterpene and coumarin constituents from the whole herbs ofCrossostephiumchinense[J].J Asian Nat Prod Res，2009，11(1)：85-90.

[17]孫麗仁，何明珍，馮育林，等.山蠟梅葉的化學成分研究[J].中草藥，2009，40(8):1214-1216.

[18]El-Hassan A，El-Sayed M，Hamed A I，et al.Bioactive constituents ofLeptadeniaarborea[J].Fitoterapia，2003，(74)：184-187.

[19]張愛軍，任鳳霞，趙毅民.藏藥獨一味化學成分的研究[J].中國藥學雜志，2011，46(2):102-104.

[20]Wei X H，Yang S J，Liang N，et al.Chemical constituents ofCaesalpiniadecapetala(Roth) Alston[J].Molecules，2013，18(1)：1325-1336.