陳 坤，余曉玲，陳凌云*

(1.云南中醫(yī)學(xué)院，昆明 650500；2.云南中醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，昆明 650051)

參威骨痹方是云南省榮譽(yù)名中醫(yī)冮順奎主任醫(yī)師潛心研究的治療骨關(guān)節(jié)炎的經(jīng)驗(yàn)方，由威靈仙、小紅參、白芍和獨(dú)活等10余味藥組成，其中小紅參和威靈仙為君藥，白芍等為臣藥，具有養(yǎng)血活血、通絡(luò)除痹之功效。該方原為湯劑，為使患者服用方便、便于攜帶，現(xiàn)擬將其開(kāi)發(fā)成醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑。根據(jù)處方中各藥味中有效成分的理化性質(zhì)，先把當(dāng)歸、川芎、獨(dú)活和桂枝4味藥混合提取揮發(fā)油[1-5]，揮發(fā)油備用；再把4味藥的藥渣與余下藥味通過(guò) L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，以干膏得率和HPLC色譜法測(cè)定的芍藥苷[6-13]轉(zhuǎn)移率綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化參威骨痹顆粒的提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1儀器 DFY-500搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；CP124C-電子天平(上海精密儀器儀表有限公司)；101-2AB-電熱鼓風(fēng)干燥器(天津市泰斯特儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(北京永光明醫(yī)療儀器廠)；UltiMate3000高效液相色譜儀(包括四元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，二極管陣列檢測(cè)器，柱溫箱)(美國(guó)戴安公司)；色譜柱C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，S/N:0J7U73，Kromat Universil)(科瑞邁公司)；分析天平(型號(hào)：AL104METTLER TOLEDO，0.000 1 g)，分析天平(型號(hào)：AL104METTLER TOLEDO, 0.000 1 g)(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；揮發(fā)油提取器(北京天連和諧儀器儀表有限公司)。

1.2試藥 小紅參、威靈仙和白芍等藥材均由云南中醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院提供；芍藥苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用，批號(hào)110736-200934，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%)；乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司，批號(hào)1685730321)；磷酸(分析純，天津市化學(xué)試劑三廠，批號(hào)110108)；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1揮發(fā)油提取工藝研究 根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際條件，選擇共水蒸餾法，以揮發(fā)油量為指標(biāo)，單因素實(shí)驗(yàn)考察浸泡時(shí)間、加水量和提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取的影響。

2.1.1浸泡時(shí)間的考察 按照處方比例,稱(chēng)取獨(dú)活、當(dāng)歸、川芎和桂枝藥材6份，每份330 g，各加10倍量水，分別浸泡1，2，3，4，5和6 h后，提取6 h，觀察揮發(fā)油含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，浸泡2 h后提取，揮發(fā)油含量為0.85 mL，隨著浸泡時(shí)間的增加，揮發(fā)油含量幾乎沒(méi)有增加，考慮生產(chǎn)實(shí)際條件，故將揮發(fā)油提取浸泡時(shí)間確認(rèn)為2 h。

2.1.2提取時(shí)間的考察 按照處方比例，稱(chēng)取獨(dú)活、當(dāng)歸、川芎和桂枝藥材共330 g,加10倍量水,浸泡2 h，每1 h觀察揮發(fā)油含量1次，直至揮發(fā)油含量不再增加為止，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取6 h后，揮發(fā)油含量為0.85 mL，且隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，揮發(fā)油含量幾乎沒(méi)有增加，且顏色加深，影響揮發(fā)油質(zhì)量，故將揮發(fā)油提取時(shí)間確認(rèn)為6 h。

2.1.3加水量的考察 按照處方比例，稱(chēng)取獨(dú)活、當(dāng)歸、川芎和桂枝4味藥材各5份,每份330 g,分別加6，8，10、12和14倍量水，浸泡2 h，提取6 h，讀取揮發(fā)油體積，結(jié)果表明，加水量為10倍量以上時(shí)，揮發(fā)油含量為0.85 mL，沒(méi)有增加，故確認(rèn)加水量為10倍量。

2.1.4揮發(fā)油提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 揮發(fā)油提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方揮發(fā)油提取的最佳工藝為浸泡2 h，加10倍量水，提取6 h。按照處方比例稱(chēng)取藥材照共3份，每份330 g，按照上述條件做工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，3份揮發(fā)油的平均含量為0.83 mL，揮發(fā)油提取率為0.258%，結(jié)果表明，該提取工藝穩(wěn)定可行。

2.2水提工藝正交優(yōu)化研究

2.2.1因素水平的確定 在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇加水倍量、提取時(shí)間和提取次數(shù)3個(gè)因素[14-17]，以干膏得率和芍藥苷轉(zhuǎn)移率綜合評(píng)分為指標(biāo)進(jìn)行考察，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，考察各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響程度大小，最終確定各參數(shù)的水平。據(jù)此選擇最佳提取工藝條件。因素水平見(jiàn)表1。

表1實(shí)驗(yàn)因素與水平

Tab.1 Experimental factors and levels

因素水平A，加水倍量/倍B，提取時(shí)間/hC，提取次數(shù)18112101．5231223

2.2.2評(píng)價(jià)指標(biāo)

2.2.2.1干膏得率的測(cè)定 按照處方比例稱(chēng)取各味飲片，共215 g，按照規(guī)定條件加水煎煮，取濾液適當(dāng)濃縮，定容至250 mL，精密吸取10 mL，置于已干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，將殘?jiān)糜?05 ℃烘箱中干燥3 h，取出，置于干燥器中冷卻30 min，迅速稱(chēng)定其質(zhì)量，計(jì)算干膏得率，見(jiàn)表3。

2.2.2.2芍藥苷含量的測(cè)定及轉(zhuǎn)移率的計(jì)算 ①色譜條件：色譜柱：C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm；以乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液(14∶86)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，流速：1 mL·min-1，柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按照芍藥苷峰計(jì)算不低于2 000[18-19]。

②溶液的制備：對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取芍藥苷對(duì)照品，加甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為132 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

藥材供試品溶液：取白芍藥材粉末0.1 g，精密稱(chēng)定，置于50 mL量瓶中，加稀乙醇(取乙醇529 mL,加水稀釋至1 000 mL，即得)35 mL，超聲處理30 min，加稀乙醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

復(fù)方供試品溶液：按照處方比例稱(chēng)取各味飲片，按照表3規(guī)定條件加水煎煮，取濾液適當(dāng)濃縮，定容至250 mL，精密吸取10 mL，置于干燥蒸發(fā)皿中，水浴揮干，殘?jiān)酉∫掖?5 mL使溶解，超聲30 min，加稀乙醇定容至50 mL，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照溶液：按照處方比例制成缺白芍的陰性樣品，按照上述復(fù)方供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

③專(zhuān)屬性考察：分別精密吸取上述制備的對(duì)照品溶液、藥材供試品溶液、復(fù)方供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。

由圖1可知，陰性對(duì)照色譜圖中，在與對(duì)照品溶液、藥材供試品溶液和復(fù)方供試品溶液色譜圖的芍藥苷峰相應(yīng)位置處無(wú)相同吸收峰，結(jié)果表明專(zhuān)屬性良好。

圖1HPLC圖

A.對(duì)照品溶液；B.藥材供試品溶液；C.復(fù)方供試品溶液；D.陰性對(duì)照溶液；1.芍藥苷。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference solution；B.herbs sample solution；C.compound sample solution;D.negative solution；1.paeoniflorin.

④線(xiàn)性范圍考察：精密稱(chēng)取芍藥苷對(duì)照品0.262 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，得質(zhì)量濃度為262 μg·mL-1的芍藥苷對(duì)照品溶液。分別精密吸取該對(duì)照品溶液1，2，5，10，15，20和25 μL，注入高效液相色譜儀，按照上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積值為縱坐標(biāo)(y)、芍藥苷進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得y=10.666x+0.381 5 (r=0.999 9)，結(jié)果表明，芍藥苷進(jìn)樣量在0.262～6.550 μg之間，峰面積與進(jìn)樣量線(xiàn)性關(guān)系良好。

⑤精密度實(shí)驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，按照上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算芍藥苷峰面積的RSD值為0.13%，結(jié)果表明，該儀器精密度良好。

⑥重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：按照處方比例，稱(chēng)取1倍處方量，煎煮，濃縮，定容，精密移取10 mL，共6份，按照復(fù)方供試品溶液制備方法進(jìn)行處理，進(jìn)行含量測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算芍藥苷含量的RSD值為1.08%(n=6)。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

⑦對(duì)照品溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液，分別于1，2，4，8，12和24 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算峰面積的RSD值為0.06%。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

⑧供試品溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液，分別于1，2，4，8，12和24 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算峰面積的RSD值為1.26%。結(jié)果表明，供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

⑨準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)：精密吸取已知含量的同一供試品溶液1 mL，共9份，分別加入適量芍藥苷對(duì)照品，精密稱(chēng)定，按照復(fù)方供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算得平均回收率為100.14%，RSD值為1.1%。結(jié)果表明，該方法回收率良好。見(jiàn)表2。

表2芍藥苷加樣回收率結(jié)果

Tab.2 Results of recovery test for paeoniflorin

序號(hào)樣品含量/mg·mL-1對(duì)照品加入量/mg理論值/mg實(shí)測(cè)值/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%12．5501．2843．8343．82599．765100．141．122．5501．2763．8263．842100．41832．5501．2733．8233．840100．44542．5502．5875．1375．259102．37552．5502．6025．1525．06098．21462．5502．5645．1145．134100．39172．5503．7856．3356．30799．55882．5503．8076．3576．33899．70192．5503．7916．3416．366100．394

⑩藥材含量測(cè)定：取白芍藥材粉末0.1 g，共3份，精密稱(chēng)定，分別置于50 mL量瓶中，加稀乙醇35 mL，超聲處理30 min，放冷，加稀乙醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果表明，3份藥材中，芍藥苷含量分別為4.88%，4.60%和4.60%，芍藥苷平均含量為4.69%，符合《中國(guó)藥典》2015年版相關(guān)規(guī)定。

芍藥苷轉(zhuǎn)移率計(jì)算：已知白芍藥材中芍藥苷含量為4.69%，則芍藥苷的轉(zhuǎn)移率=液相測(cè)得的芍藥苷含量÷4.69%×方中白芍藥材用量×100%

2.2.2.3綜合評(píng)分 選擇芍藥苷轉(zhuǎn)移率及浸膏得率的綜合評(píng)分為指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)分別為70%和30%。

綜合評(píng)分=芍藥苷轉(zhuǎn)移率÷芍藥苷轉(zhuǎn)移率的最大值×70%+浸膏得率÷浸膏得率的最大值×30%

2.2.3正交實(shí)驗(yàn)安排與結(jié)果 正交實(shí)驗(yàn)安排與結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。由表3和表4可知，各因素影響水提工藝的順序?yàn)?C>B>A，因素B和C對(duì)提取工藝有顯著影響，因素A對(duì)提取工藝無(wú)顯著性影響，應(yīng)選擇提取工藝為A1B3C3，但考慮到實(shí)際生產(chǎn)，綜合考慮，選擇A1B3C2，即加8倍量水，煎煮2次，每次2 h。

表3正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.3 The results of orthogonal experiment

實(shí)驗(yàn)號(hào)因素ABCD干浸膏率/%芍藥苷轉(zhuǎn)移率/%綜合評(píng)分1111125．8251．2059．682122233．2971．2282．243133339．4590．63100．004212335．1473．3384．815223137．6857．6073．906231230．5061．4071．887313237．4270．4785．258321330．5561．8172．239332134．7881．8691．11綜合評(píng)分K180．64076．58067．93074．897K276．86376．12386．05379．790K382．86387．66386．38385．680R6．00011．54018．45310．783

表4芍藥苷轉(zhuǎn)移率方差分析結(jié)果

Tab.4 The variance results of paeoniflorin transfer rate

因素偏差平方和自由度FF臨界值顯著性A100．68720．47719．000P>0．05B378．10621．79019．000P<0．05C211．29022．48519．000P<0．05誤差211．2902

注：F(2,2)0.05=19.00。

2.2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為保證優(yōu)選所得水提工藝合理可行，對(duì)該工藝進(jìn)行了3次驗(yàn)證。取1倍處方量藥材3份，分別加8倍量水浸泡1 h后，按照A1B3C2提取，經(jīng)計(jì)算得干膏得率分別為37.27%，37.09%和36.84%，芍藥苷轉(zhuǎn)移率分別為80.56%，81.77%和80.72%，二者的RSD值分別為0.58%和1.21%(n=3)，結(jié)果顯示，該工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

該處方是云南省榮譽(yù)名中醫(yī)冮順奎主任醫(yī)師潛心研究的治療骨關(guān)節(jié)炎的經(jīng)驗(yàn)方，具有良好的臨床效果。本實(shí)驗(yàn)研究為攜帶更方便、患者順應(yīng)性更好、更適宜臨床應(yīng)用的醫(yī)院內(nèi)中藥制劑，口服制劑一般包括合劑、口服液、膏滋劑、顆粒劑、膠囊劑和片劑等，根據(jù)本院制劑室實(shí)際情況，研究選用膏滋劑、顆粒劑和片劑3種劑型，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇顆粒劑作為該復(fù)方的合適劑型。

在設(shè)計(jì)復(fù)方提取工藝時(shí)，考慮到因其含多味揮發(fā)性藥材，故采取先提取揮發(fā)油的工藝過(guò)程，為后期揮發(fā)油的包合工藝奠定基礎(chǔ)。

本方中君藥之一為小紅參，其化學(xué)成分多為蒽醌類(lèi)，難溶于水，另一味君藥威靈仙，依照《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定對(duì)齊墩果酸進(jìn)行含量測(cè)定，齊墩果酸為脂溶性成分，未納為評(píng)價(jià)指標(biāo)；綜合考慮，采用臣藥白芍中芍藥苷的轉(zhuǎn)移率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，由于方中藥味較多，成分復(fù)雜，故結(jié)合干膏率兩者共同作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合評(píng)分中干膏得率和芍藥苷轉(zhuǎn)移率的權(quán)重系數(shù)分別為0.3和0.7，這樣得出的分?jǐn)?shù)較為合理。

本研究通過(guò)干膏率和芍藥苷的含量對(duì)各正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行考察，進(jìn)行直觀分析和方差分析，結(jié)果表明，煎煮時(shí)間和煎煮次數(shù)對(duì)干膏率和芍藥苷的含量均有顯著影響。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)選擇A1B3C3，即加8倍量的水，煎煮2 h，煎煮3次，但結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)條件，在節(jié)約各項(xiàng)資源又確保療效的情況下，選擇A1B3C2，即藥材加8倍量的水，煎煮2 h，煎煮2次。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的最佳工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，產(chǎn)品的干膏率和芍藥苷含量穩(wěn)定、重復(fù)性好，為參威骨痹顆粒的進(jìn)一步研究提供了技術(shù)支持。

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