何淑貞,蒲育棟,蘇煥厚,曹金如,莫麗芳
地中海貧血是一種遺傳性溶血性貧血疾病,由基因缺陷導致機體珠蛋白合成受阻,引起患者貧血或臨床病理狀態(tài),一般從出生時就出現(xiàn)貧血、黃疸、發(fā)育不良等癥狀[1-2]。地中海貧血是重點防范遺傳性疾病之一,華南、西南地區(qū)是我國地中海貧血高發(fā)地區(qū),特別是廣西、廣東、四川等地區(qū)[3]。因此,孕前或孕期篩查,對預防地中海貧血患兒的出生十分關(guān)鍵。目前臨床上主要是針對23種常規(guī)地貧基因進行篩查,操作過程復雜,且對檢測人員要求較高。而高通量測序技術(shù)(NGS)可一次性檢測300多種地貧基因,篩查范圍廣,局限性小。因此,本研究以405例廣東籍夫婦為研究對象,探討NGS與常規(guī)篩查方法對地中海貧血基因篩查的結(jié)果。
1.1 研究對象 選取2014年10月~2016年10月在醫(yī)院進行地中海貧血基因篩查的405例廣東籍夫婦為研究對象,其中男147例,女258例;年齡20~35(27.36±4.20)歲。 納入標準:(1)通過血常規(guī)檢測,被視為地中海貧血篩查陽性患者[平均紅細胞體積(MCV)<82 fl,紅細胞平均血紅蛋白量<27 pg,滿足任意一項,被視為地中海篩查陽性患者]。(2)擬行地中海貧血基因篩查。(3)無其他血液性疾病。排除標準:(1)基本資料不全;(2)患有其他血液性疾?。唬?)精神異常或認知功能障礙。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準。
1.2 檢測方法 用EDTA抗凝管采集研究對象外周血,每人2管,每管約2 ml,分別用于常規(guī)地中海貧血基因檢測和高通量測序地貧基因篩查。
1.2.1 常規(guī)篩查 采用跨越斷裂點的PCR(gap-PCR)方法:利用基因檢測試劑盒(深圳亞能生物技術(shù)有限公司)進行基因診斷,檢測3種缺失型(-SEA、-α3.7 與-α4.2)α-地中海貧血基因。
采用反向點雜交(RDB)技術(shù),檢測非缺失型(HbWS、HbCS 與 HbQS)α-地中海貧血基因突變及17種β-地中海貧血基因突變(包括71/71M、-28M、-29M、31M、32M、CAP、654M、14-15M、17M、41-42M、43M、βEM、27/28M、IVS1-1M、IVS1-5M、IntM、30M)。
1.2.2 高通量測序 血液樣本-20℃儲存,寄往深圳華大基因公司,經(jīng)檢測合格后,首先進行DNA提取、純化及質(zhì)量鑒定,之后文庫構(gòu)建和定量檢測,然后采用HiSeq2500(Illumina)測序平臺,采用雙端測序方法,測序長度為150 bp,進行基因組測序,并進行生物信息學分析。
1.3 觀察指標 統(tǒng)計兩種方法篩查結(jié)果,檢測結(jié)果均為陰性的排除地貧,檢測結(jié)果均為陽性者確診為地貧攜帶者,計算兩組檢查結(jié)果符合率。對兩組結(jié)果不一致的樣本,進行Sanger驗證(缺失重復突變用Q-PCR進行驗證),確定相關(guān)基因是否變異,分別統(tǒng)計兩種方法的假陽性率、假陰性率、檢出率,并計算兩組每個樣本平均檢測費用。
1.4 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件分析,計量資料以±s表示,行t檢驗;計數(shù)資料以例和百分率表示,行χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 兩組基因檢測結(jié)果比較 通過常規(guī)篩查、高通量技術(shù)及Sanger或Q-PCR驗證,共確認249例基因檢測為陽性,其中α-地中海貧血基因168例(67.47%),β-地中海貧血基因72例(28.92%),α、β-地中海貧血基因9例(3.61%)。對照組檢出221例(88.76%),研究組檢測出247例(99.20%),研究組的檢出率高于對照組,但差異尚無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
2.2 兩組基因篩查結(jié)果比較 研究組檢測23種常規(guī)地中海貧血基因的結(jié)果與對照組基本一致(表1)。此外,研究組還檢測出25例對照組未檢測出的7種突變(4 例 HbHekinan:α27,6 例 HbOwari:α121,3例 HbQ-Thailand:α74,5 例 Hb Hamilton:β11,2 例 Hb New York:β113,3 例 HBB:c.-23,2 例 HBB:c.316-148),與Sanger或Q-PCR驗證結(jié)果完全一致。
2.3 兩組樣本平均檢測費用比較 觀察組每份樣本平均檢測費用為(550.88±60.31)元,顯著高于對照組的(423.47±61.44)元(P<0.05)。
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地中海貧血是臨床重點預防的遺傳性疾病,孕期或孕前地中海貧血基因篩查是防止地中海貧血患兒出生的關(guān)鍵[4-5]。目前臨床上常用的基因檢測方法大多還停留在跨越斷裂點PCR及膜芯片反向雜交聯(lián)合檢測,步驟繁瑣,對檢測技術(shù)人員要求較高,并且跨越斷裂點PCR主要是針對α-地貧基因的檢測,而膜芯片反向雜交主要是針對β-地貧基因,局限較大[6]。而高通量測序可一次檢測338種地中海貧血基因突變,效率較高,且準確率高。
在本研究中,405例疑似地中海貧血癥者中,共確認249例基因檢測為陽性,其中常規(guī)篩查檢出221例(88.76%),高通量測序檢測出247例(99.20%)。其中NGS檢測23種常規(guī)地貧基因的結(jié)果與常規(guī)篩查方法相同。同時研究組還檢測出25例對照組未檢測出的7種基因突變類型,且與Sanger測序或QPCR驗證結(jié)果完全一致。提示研究組的檢出率高于對照組,同時研究組還檢測出對照組未檢測出的突變基因型,表明高通量測序技術(shù)可提高檢出率,且檢測范圍廣、效率高,有利于臨床地中海貧血基因的篩查,與陳芳等[7]在母血中胎兒游離DNA進行地中海貧血的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷研究結(jié)果相似。
高通量測序技術(shù)從分子生物學的角度去解讀樣本的生物信息,具有高效性、廣譜性及較高的準確性。本研究結(jié)果顯示,觀察組單個樣本基因檢測平均費用顯著高于對照組(P<0.05),由于NGS需要在華大基因進行檢測,所以在費用方面處于劣勢。但近年來二代測序平臺不斷更迭,測序成本正在逐漸下降,因此,未來測序成本將不會是高通量測序技術(shù)臨床應(yīng)用的限制因素。
總之,高通量測序技術(shù),檢出率較高,篩查范圍廣,效率高,有利于臨床地中海貧血基因的篩查。
【參考文獻】
[1]張瀚文,朱寶生.地中海貧血的治療進展及預防[J].中國婦幼保健,2016,31(3):666-668.
[2]杜萌,朱寶生,呂濤.地中海貧血致病機制及基因治療進展[J].醫(yī)學動物防制,2017(1):58-61.
[3]楊陽,張杰.中國南方地區(qū)地中海貧血研究進展[J].中國實驗血液學雜志,2017,25(1):276-280.
[4]余蕾,張蕾,顧峻嫣,等.高通量測序技術(shù)篩查單基因隱性遺傳病[J].臨床檢驗雜志,2015,33(7):481-484.
[5]李兵,尹愛華,駱明勇,等.廣東省常用的3種β地中海貧血產(chǎn)前篩查方案的臨床篩查效果比較[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2015(6):434-440.
[6]李朋,張杰.地中海貧血基因檢測方法的研究進展[J].中國婦幼保健,2016,31(4):891-894.
[7]陳芳,朱斌,周萍.母血中胎兒游離DNA進行地中海貧血的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷研究[J].中國當代醫(yī)藥,2016,23(28):111-113.